Terapeutický Manuka med: Už nie je taký alternatívny

Úvod

Med sa používal ako liek počas celej histórie ľudstva. Jedným z najbežnejších a najtrvalejších terapeutických využití medu bolo použitie ako obväz na rany, takmer určite kvôli jeho antimikrobiálnym vlastnostiam. S príchodom vysoko účinných antibiotík v 60. rokoch 20. storočia bol med odmietnutý ako „bezcenná, ale neškodná látka“ (Soffer, 1976). Avšak súčasná a rastúca kríza rezistencie na antibiotiká oživila záujem o použitie medu, a to ako účinného činidla samostatne, tak aj ako terapeutického východiska na vývoj nových metód liečby. Med sa zvyčajne získava z nektáru kvetov a vyrába ho včely, najčastejšie európska včela medonosná Apis mellifera, a je zložený z komplexnej zmesi cukrov, aminokyselín, fenolov a ďalších látok. Typy medu pochádzajúce z rôznych kvetov sa výrazne líšia vo svojej schopnosti ničiť baktérie, čo skomplikovalo literatúru o mede a niekedy sťažilo reprodukovanie výsledkov v rôznych štúdiách (Allen et al., 1991; Irish et al., 2011). Väčšina nedávnych štúdií skúmajúcich mechanizmus účinku medu sa zamerala na dobre charakterizovaný, štandardizovaný aktívny Manuka med produkovaný určitými druhmi Leptospermum pôvodnými na Novom Zélande a v Austrálii, ktorý bol registrovaný ako produkt na starostlivosť o rany príslušnými lekárskymi regulačnými orgánmi. Preto, pokiaľ nie je uvedené inak, táto recenzia sa bude zameriavať na Manuka med.

Chemické analýzy aktívneho Manuka medu

Profesor Peter Molan z Univerzity Waikato na Novom Zélande bol prvý, kto v polovici 80. rokov 20. storočia oznámil neobvyklú aktivitu manukového medu a začal testovať jeho účinky proti širokému spektru rôznych bakteriálnych druhov. Hoci bolo jasné, že aj nízke koncentrácie manukového medu zabíjajú bakteriálne patogény, konkrétna aktívna zložka zodpovedná za tento účinok zostávala mnoho rokov neznáma. Vysoký obsah cukru a nízke pH robia med inhibičným pre rast mikroorganizmov, no aktivita pretrváva aj pri ich zriedení na zanedbateľné úrovne. Mnohé rôzne druhy medu tiež produkujú peroxid vodíka, keď glukóza oxidáza, ktorá pochádza z včely medonosnej, reaguje s glukózou a vodou. Avšak v manukovom mede je produkcia peroxidu vodíka relatívne nízka a môže byť neutralizovaná katalázou, no aktivita stále pretrváva. Príčina tejto zostávajúcej aktivity, nazývanej „aktivita bez peroxidu“ alebo NPA, bola nakoniec odhalená v roku 2008, keď dve laboratóriá nezávisle identifikovali metylglyoxál (MGO) v manukovom mede (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008). MGO vzniká spontánnou dehydratáciou svojho prekurzora dihydroxyacetónu (DHA), prírodného fytochemikálu nachádzajúceho sa v nektári kvetov Leptospermum scoparium, Leptospermum polygalifolium a niektorých príbuzných druhoch Leptospermum pôvodných na Novom Zélande a v Austrálii (Adams et al., 2009; Williams et al., 2014; Norton et al., 2015). MGO môže relatívne nespecificky reagovať s makromolekulami, ako sú DNA, RNA a proteíny (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008; Majtan et al., 2014b) a teoreticky by mohol byť toxický pre cicavčie bunky (Kalapos, 2008). Avšak neexistujú dôkazy o poškodení hostiteľských buniek pri orálnom požití manukového medu alebo jeho použití ako obväzu na rany; naopak, med sa javí ako stimulátor hojenia a znižuje tvorbu jaziev pri aplikácii na rany (Biglari et al., 2013; Majtan, 2014; Dart et al., 2015). Ako presne vyvoláva túto zdanlivo selektívnu toxicitu voči bakteriálnym bunkám, nie je známe.

Vysoké hladiny MGO alebo peroxidu vodíka zvyčajne produkujú najaktívnejší med, avšak korelácia nie je vždy dokonalá, čo naznačuje, že iné zložky medu môžu modulovať jeho aktivitu (Molan, 2008; Kwakman et al., 2011; Chen et al., 2012; Lu et al., 2013). Bee defensin-1, antimikrobiálny peptid pochádzajúci od včiel, je zodpovedný za aktivitu v mede Revamil, aktívnom mede vyrobenom z nešpecifikovaného zdroja, ale zdá sa, že je štrukturálne modifikovaný a neaktívny v Manuka mede (Kwakman et al., 2011; Majtan et al., 2012). Hladina leptosínu, glykosidu nájdeného výlučne v mede Leptospermum, koreluje s účinnosťou a môže modulovať antimikrobiálnu aktivitu Manuka medu (Kato et al., 2012). Podobne môžu byť prítomné rôzne fenolické zlúčeniny s potenciálnou antimikrobiálnou aktivitou, najmä v tmavších medoch, a hoci sa vyskytujú v hladinách, ktoré samy o sebe pravdepodobne nebudú inhibičné, môžu synergicky pôsobiť navzájom alebo s inými zložkami medu a vytvárať alebo meniť aktivitu (Estevinho et al., 2008; Stephens et al., 2010). Fenolické zlúčeniny môžu tiež pôsobiť ako antioxidanty a môžu byť zodpovedné za protizápalové a hojivé vlastnosti medu (Stephens et al., 2010). Treba poznamenať, že nie všetky druhy Leptospermum produkujú aktívny med, a dokonca aj v mede L. scoparium a L. polygalifolium sa hladiny MGO môžu pohybovať od približne 100 do viac ako 1200 ppm (Windsor et al., 2012). Prieskum aktivity austrálskeho medu zistil, že med pochádzajúci z rastlín Leptospermum rastúcich v okolí hranice Nový Južný Wales – Queensland bol obzvlášť aktívny, ale či je to spôsobené rastlinou, pôdou, podnebím alebo inými faktormi, nie je známe (Irish et al., 2011).

Inhibícia patogénov medom

Med bol testovaný in vitro na rôznych patogénoch, najmä tých, ktoré môžu kolonizovať pokožku, rany a sliznice, kde je možná lokálna liečba medom. Doteraz in vitro testy preukázali, že manukový med môže účinne inhibovať všetky testované problematické bakteriálne patogény (zhrnuté v tabuľke 1). Zvlášť zaujímavé je, že klinické izoláty s fenotypmi multirezistencie (MDR) nevykazujú zníženú citlivosť na med, čo naznačuje široké spektrum účinku, ktoré je odlišné od akéhokoľvek známeho antimikrobiálneho prostriedku (Willix et al., 1992; Blair and Carter, 2005; George and Cutting, 2007; Tan et al., 2009). Navyše, pokusy o vytvorenie medu odolných kmeňov v laboratóriu neboli úspešné a neboli hlásené žiadne klinické izoláty s nadobudnutou rezistenciou na med (Blair et al., 2009; Cooper et al., 2010).

Okrem inhibície planktonických buniek môže med rozptýliť a zabiť baktérie žijúce v biofilmoch. Biofilmy sú spoločenstvá buniek, ktoré sú zvyčajne uzavreté v samo-vytvorenom extracelulárnom matrixe a nachádzajú sa prichytené na povrchoch, vrátane rán, zubov, slizničných povrchov a implantovaných zariadení. Mikróby žijúce v biofilmoch sú chránené pred antimikrobiálnymi látkami a môžu spôsobovať pretrvávajúce, nevyriešené infekcie. Manuka med narušuje bunkové agregáty (Maddocks et al., 2012; Roberts et al., 2012) a zabraňuje tvorbe biofilmov širokým spektrom problematických patogénov, vrátane druhov Streptococcus a Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii a Klebsiella pneumonia (Maddocks et al., 2012, 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a; Halstead et al., 2016). Dôležité je, že med môže tiež narušiť už vytvorené biofilmy a zabiť rezidentné bunky, hoci na to je potrebná vyššia koncentrácia ako pri planktonických bunkách (Okhiria et al., 2009; Maddocks et al., 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a). Nedávno bol manuka med testovaný na multispecifickom biofilme obsahujúcom Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa a Enterococcus faecalis a zistilo sa, že znižuje životaschopnosť všetkých druhov okrem E. faecalis, ktorý nebolo možné eradikovať (Sojka et al., 2016). Toto má jasné klinické dôsledky pre použitie medu na rany obsahujúce biofilmy a pochopenie, ako biofilm umožňuje E. faecalis prežiť, keď je normálne medom zabíjaný, je dôležitou a zaujímavou oblasťou budúceho výskumu. MGO sa javí ako väčšinou, ale nie úplne zodpovedný za inhibíciu biofilmov manuka medom, čo opäť zdôrazňuje význam ďalších zložiek, ktoré modulujú aktivitu (Kilty et al., 2011; Lu et al., 2014).

Spektrum účinku medu voči nebakteriálnym patogénom ešte nie je dobre stanovené. Nedávne štúdie skúmajúce antivírusový účinok Manuka medu naznačili jeho potenciál na liečbu vírusu varicella-zoster (príčina ovčích kiahní a pásového oparu) (Shahzad a Cohrs, 2012) a chrípky (Watanabe et al., 2014). Kožné plesňové patogény, vrátane Candida albicans a dermatofytových druhov, sú podstatne menej citlivé na Manuka med ako baktérie, ale sú inhibované medom s vysokou produkciou peroxidu vodíka (Brady et al., 1996; Irish et al., 2006). Manuka a nemanuka med boli zistené ako znižujúce životaschopnosť spór mikrosporídie Nosema apis, dôležitého patogéna včiel, ale med nemohol vyliečiť infekciu včiel, ak už bola rozvinutá (Malone et al., 2001). Štúdií o použití medu proti protozoálnym alebo helmintovým parazitom je veľmi málo a tieto nevyužívali med s dobre charakterizovanou aktivitou, čo sťažuje hodnotenie významu ich zistení (Bassam et al., 1997; Nilforoushzadeh et al., 2007; Sajid a Azim, 2012).

Zavádzanie medu do hlavného prúdu medicíny: Nedávne experimentálne a mechanistické štúdie osvetľujú, ako med funguje

Aktívny manukový med je široko dostupný ako terapeutický prostriedok a funkčná potravina a väčšina spotrebiteľov ho prijíma ako holistický, trochu záhadný produkt. Nedostatok pochopenia, ako med zabíja baktérie a podporuje hojenie, však obmedzuje jeho prijatie v hlavnom prúde medicíny, kde je stále považovaný za „alternatívny“ alebo „doplnkový“. Väčšina doterajších výskumných štúdií o mede bola popisná, no nedávne štúdie sa snažia rozlúštiť, ako med funguje, a používajú mechanistické prístupy na určenie jeho účinku na bunkovej a molekulárnej úrovni.

Ultrastrukturálne štúdie bakteriálnych buniek a spoločenstiev ošetrených medom

Med môže výrazne meniť veľkosť a tvar bakteriálnych buniek, hoci rozsah týchto zmien sa líši u rôznych bakteriálnych druhov. Pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM) mali kultúry S. aureus ošetrené manukovým medom viac buniek s dokončenými septami v porovnaní s tými ošetrenými umelým medom, čo naznačuje, že bunky vstúpili, ale nedokončili štádium delenia bunkového cyklu, hoci zvonku tieto bunky vyzerali normálne podľa skenovacej elektrónovej mikroskopie (SEM) (Henriques et al., 2010). Nedávnejšie zistenia pomocou fázovo-kontrastného zobrazovania po ošetrení subletálnou dávkou manukového medu ukázali, že bunky S. aureus a Bacillus subtilis boli výrazne menšie a pravdepodobnejšie mali kondenzovanú DNA ako tie rastúce bez medu (Lu et al., 2013). Priame porovnanie týchto štúdií je ťažké, pretože používali rôzne množstvá medu a časy ošetrenia, ale celkovo výsledky naznačujú oddelenie rastu a delenia buniek, čo je často pozorované ako reakcia na nutričné a environmentálne stresy (Silva-Rocha and de Lorenzo, 2010).

Liečba medom bola hlásená ako príčina, že kultúry gramnegatívnych druhov E. coli a P. aeruginosa majú abnormálne kratšie aj dlhšie bunky (Lu et al., 2013). Zaujímavé je, že hoci sa P. aeruginosa javí ako menej citlivá na inhibíciu medom v porovnaní s inými druhmi, pomocou TEM a SEM boli pozorované výrazné bunkové zmeny, vrátane brázd a výčnelkov (výčnelky plazmatických membrán) na povrchu bunky a značného množstva extracelulárneho odpadu, čo naznačuje lýzu buniek (Henriques et al., 2011). Toto bolo potvrdené v následnej štúdii použitím BacLight živé-mŕtve fluorescenčného farbenia a konfokálnej mikroskopie, hoci táto tiež ukázala, že relatívne veľké množstvo živých buniek zostalo. Tieto štúdie používali 20 % (hmotn./obj.) med, čo bolo viac ako MBC pre ich kmeň P. aeruginosa a očakávalo sa značné potlačenie a úhyn. Avšak atómová silová mikroskopia (AFM) pri sub-baktericídnych hladinách stále zistila značné deformácie buniek a výčnelky u buniek ošetrených koncentráciami MIC (12 %) a polovicou MIC (6 %), spolu so značnou lýzou buniek (Roberts et al., 2012). Tento zjavný rozklad bunky P. aeruginosa podporila kvantitatívna PCR analýza, ktorá ukázala 10-násobné zníženie expresie oprF v bunkách ošetrených medom, čo kóduje vonkajší membránový porín dôležitý pre štrukturálnu stabilitu (Jenkins et al., 2015a).

Analýzy 'Omics hodnotia reakciu celej bunky na inhibíciu medom

Schopnosť hodnotiť výstupy celej bunky zrevolucionalizovala štúdium interakcií liekov s patogénmi a má osobitnú hodnotu pre komplexné prírodné produkty ako med, kde sú pravdepodobné účinky na viaceré procesy. Štúdie mikroarray a proteomiky baktérií vystavených medu naznačili indukciu procesov súvisiacich so stresom a potlačenie syntézy proteínov (Blair et al., 2009; Jenkins et al., 2011; Packer et al., 2012). Hoci je to celkovo dosť typické pre odpoveď na inhibičné činidlá, med vytvoril jedinečný „podpis“ diferenciálnej expresie, ktorý zahŕňal mnoho proteínov s hypotetickými alebo neznámymi funkciami, čo naznačuje nový spôsob účinku. Špecifické gény alebo proteíny, ktoré boli zistené ako down-regulované v ‘omických analýzach S. aureus a E. coli O157/H7, majú funkcie súvisiace s virulenciou, quorum sensingom a tvorbou biofilmu (Lee et al., 2011; Jenkins et al., 2013), a u P. aeruginosa došlo k down-regulácii proteínov zapojených do tvorby bičíkov (Roberts et al., 2015). Tieto fenotypy sú kľúčové pre patogény na etablovanie a vyvolanie invazívnej infekcie a naznačujú, že okrem inhibície rastu môže med znížiť patogénny potenciál infikujúcich baktérií.

Hoci sú doterajšie ‘omické analýzy stále relatívne obmedzené počtom a rozsahom, naznačujú komplexnú bunkovú odpoveď na med s výraznými rozdielmi medzi rôznymi bakteriálnymi druhmi. Pokročilé prístupy systémovej biológie, ktoré umožňujú kontextualizáciu dát, a validačné štúdie využívajúce kvantitatívnu PCR a kmene s vymazanými génmi, sú teraz potrebné na rozlúsknutie tejto komplexnosti, a môžu odhaliť nové prístupy k liečbe zameranej na inhibíciu rastu baktérií (Hudson et al., 2012).

Interakcie medzi medom a konvenčnými antibiotikami

Okrem použitia ako samostatného činidla existuje možnosť využitia medu na doplnenie liečby konvenčnými antibiotikami. Toto môže mať osobitnú hodnotu, keď sa kombinuje so systémovými činidlami, ktoré môžu byť dodané do rany cez krvný obeh, zatiaľ čo med sa aplikuje lokálne. Kombinované liečby môžu tiež znížiť terapeutickú dávku antimikrobiálnych činidiel a zabrániť rozvoju rezistencie, a v niektorých prípadoch môžu viesť k synergií liekov, kde je kombinovaná aktivita väčšia ako súčet individuálnych aktivít každého liečivého partnera.

In vitro štúdie kombinujúce terapeuticky schválený manuka med s antibiotikami preukázali synergický účinok s oxacilínom, tetracyklínom, imipenemom a mupirocínom proti rastu kmeňa MRSA (Jenkins a Cooper, 2012). Okrem toho prítomnosť subinhibičnej koncentrácie medu v kombinácii s oxacilínom obnovila citlivosť kmeňa MRSA na oxacilín. Autori zistili down-reguláciu mecR1, ktorý kóduje MRSA-špecifický penicilín-väzbový proteín (PBP2A), a navrhli to ako mechanizmus synergie medu. Silná synergická aktivita medzi manuka medom a rifampicínom proti viacerým kmeňom S. aureus, vrátane klinických izolátov a kmeňov MRSA, bola tiež preukázaná, pričom prítomnosť medu zabránila vzniku rezistencie na rifampicín in vitro (Müller et al., 2013). Toto má klinický význam, pretože rifampicín dobre preniká do tkanív a abscesov a bežne sa používa na liečbu povrchových stafylokokových infekcií, ale rýchlo indukuje rezistenciu, a preto musí byť používaný v kombinácii s iným liečivom. Ďalším zistením tejto štúdie bolo, že synergia nebola spôsobená MGO, pretože syntetický med obohatený o MGO nebol synergický s rifampicínom.

Pochopenie toho, ako med ovplyvňuje účinok antimikrobiálnych látok s dobre charakterizovanými mechanizmami účinku, môže tiež ďalej rozšíriť naše poznatky o tom, ako med ovplyvňuje bakteriálne patogény. Liu et al. (2014) rozšírili analýzu synergie o ďalšie antibiotiká a rôzne kmene S. aureus a MRSA. Navrhli, že zvýšená citlivosť na klindamycín a gentamicín môže byť výsledkom kombinovaného účinku medu, ktorý znižuje syntézu proteínov, a inhibície ribozómov antibiotikami, zatiaľ čo synergia s β-laktámovými antibiotikami môže byť spôsobená zvýšeným oxidačným stresom vyvolaným oboma partnermi. Keďže kmene S. aureus a MRSA boli rovnako citlivé na kombináciu oxacilínu a medu, zdalo sa, že synergia pravdepodobne nie je spôsobená down-reguláciou PBP2A. Avšak u jedného klinického izolátu MRSA nedošlo k zvýšeniu citlivosti na klindamycín alebo gentamicín v prítomnosti medu, čo je pozoruhodné, pretože ide o prvý zaznamenaný prípad rozdielnej reakcie MRSA oproti S. aureus na med. Preskúmanie tohto špecifického rozdielu pomocou transkriptomických alebo proteomických analýz by bolo zaujímavým smerom pre budúci výskum (Liu et al., 2014).

Dôkazy účinnosti z experimentov na zvieratách, prípadových štúdií a klinických skúšok

Spoločnosti vyrábajúce a predávajúce manuka med podporujú vysoké etické štandardy a odrádzajú od používania zvieracích modelov na štúdium infekcií a hojenia rán. Manuka med sa však používal na liečbu zvierat so chirurgickými alebo náhodnými ranami, najmä koní, s pozitívnymi výsledkami (Dart et al., 2015; Bischofberger et al., 2016). Prípadové štúdie využívajúce med na nehojace sa rany a vredy zaznamenali výrazné zlepšenie s vymiznutím infekcie tam, kde konvenčné antibiotiká zlyhali (Regulski, 2008; Smith et al., 2009). Napriek tomu a dôkazom z mnohých in vitro a in vivo modelov, že med ničí problematické patogény rán, chýbajú robustné klinické údaje o manuka mede. Existuje niekoľko dôvodov, vrátane technických ťažkostí pri vykonávaní dvojito zaslepených placebom kontrolovaných štúdií na charakteristickej látke ako med, etických úvah, nedostatku záujmu klinických lekárov a pomeru nákladov a prínosov pre spoločnosti vyrábajúce med, ktorých zameranie je na prírodné produkty a predaj bez lekárskeho predpisu, kde manuka med a súvisiace obväzy už majú prémiovú cenu. Toto sa môže zmeniť, keď rezistencia na antibiotiká zníži súčasné možnosti liečby a prebiehajúci výskum zdôrazňujúci potenciál medu pritiahne pozornosť lekárov.

Medzery a vznikajúce príležitosti v štúdiu medu

V poslednej dobe sme dosiahli veľký pokrok v našom chápaní terapeutického medu, no jeho použitie v klinickej medicíne zostáva obmedzené, aj keď konvenčné antibiotiká začínajú zlyhávať. Zložitosť medu, ktorá je pravdepodobne jeho najväčšou silou pri ničení rôznych patogénov a zabraňovaní rezistencii, komplikuje jeho štúdium, pretože mnoho faktorov pôsobiacich spoločne pravdepodobne ovplyvňuje jeho aktivitu. Odporúčame ďalšie mechanistické štúdie s použitím primerane registrovaného terapeutického manuka medu, najmä štúdie využívajúce neredukcionistické systémy biológie, spolu s podrobnými chemickými a mikrobiologickými analýzami na objasnenie, ako med pôsobí na molekulárnej, bunkovej a populačnej úrovni, ako sa to môže líšiť u rôznych kmeňov a druhov mikrobiálnych patogénov a ako na to reaguje hostiteľská bunka (Tabuľka 2). Informácie získané z týchto štúdií môžu následne informovať terapiu a vytvoriť klinické údaje potrebné na zaradenie medu do bežnej medicíny; už nie ako alternatívna terapia používaná len vtedy, keď všetko ostatné zlyhá.

Príspevky autorov

Túto recenziu napísali DC, SB, NNC, DB a PB a kriticky ju prehodnotili RS a EH.

Financovanie

NNC dostáva platovú podporu od Rural Industries Research and Development Corporation – Honey Bee Program (Grant PRJ-009186).

Vyhlásenie o konflikte záujmov

DC, PB a EH uvádzajú grantovú a nefinančnú podporu vo forme manuka medu od Comvita NZ Limited a Capilano Honey Limited; RS je zamestnancom Comvita NZ Limited, ktorá obchoduje s lekárskym manuka medom (Medihoney).

Ostatní autori prehlasujú, že výskum bol vykonaný bez akéhokoľvek komerčného alebo finančného vzťahu, ktorý by mohol byť považovaný za potenciálny konflikt záujmov.

Skratka

ESBL, rozšírená spektrálna β-laktamáza; MBC, minimálna baktericídna koncentrácia; MGO, metylglyoxal; MIC, minimálna inhibičná koncentrácia; MRSA, meticilín-rezistentný Staphylococcus aureus; MRSE, meticilín-rezistentný Staphylococcus epidermis; NPA, neperoxidová aktivita; VRE, vancomycín-rezistentný Enterococcus.

Referencie