Terapeutický Manuka med: Už nie je taký alternatívny

Úvod

Med sa v dejinách ľudstva používal ako liek. Jedným z najbežnejších a najtrvalejších terapeutických využití medu bolo jeho použitie na ošetrovanie rán, takmer určite vďaka jeho antimikrobiálnym vlastnostiam. S nástupom vysoko účinných antibiotík v 60. rokoch 20. storočia bol med zavrhnutý ako „bezcenná, ale neškodná látka“ (Soffer, 1976). Súčasná a stále sa prehlbujúca kríza antibiotickej rezistencie však obnovila záujem o používanie medu, a to ako účinného prostriedku samého osebe, ako aj východiska na vývoj nových liečebných metód. Med zvyčajne pochádza z nektáru kvetov a produkujú ho včely, najčastejšie včela medonosná európska Apis mellifera; ide o komplexnú zmes cukrov, aminokyselín, fenolových látok a ďalších zložiek. Druhy medu pochádzajúce z rôznych kvitnúcich rastlín sa výrazne líšia schopnosťou ničiť baktérie, čo skomplikovalo odbornú literatúru o mede a niekedy sťažilo reprodukovanie výsledkov v rôznych štúdiách (Allen et al., 1991; Irish et al., 2011). Väčšina najnovších štúdií skúmajúcich mechanizmus účinku medu sa zamerala na dobre charakterizovaný a štandardizovaný aktívny med Manuka, ktorý produkujú niektoré druhy rodu Leptospermum pôvodom z Nového Zélandu a Austrálie a ktorý bol zaregistrovaný ako výrobok na ošetrovanie rán u príslušných regulačných orgánov v oblasti zdravotníctva. Ak teda nie je uvedené inak, táto štúdia sa zameria na med Manuka.

Chemické analýzy aktívneho medu Manuka

Profesor Peter Molan z Waikato University na Novom Zélande ako prvý opísal nezvyčajnú aktivitu medu Manuka a v polovici 80. rokov 20. storočia začal testovať jeho účinok proti širokému spektru rôznych bakteriálnych druhov. Hoci bolo zrejmé, že aj nízke koncentrácie medu Manuka ničia bakteriálne patogény, konkrétna účinná zložka zodpovedná za tento účinok zostávala mnoho rokov neobjasnená. Vysoký obsah cukru a nízke pH brzdia mikrobiálny rast v mede, no jeho aktivita pretrváva aj po zriedení týchto faktorov na zanedbateľnú úroveň. Mnohé rôzne druhy medu tiež vytvárajú peroxid vodíka, keď glukózooxidáza pochádzajúca od včely medonosnej reaguje s glukózou a vodou. V mede Manuka je však tvorba peroxidu vodíka pomerne nízka a kataláza ju môže neutralizovať, pričom aktivita stále pretrváva. Príčina tejto zostávajúcej aktivity, označovanej ako „aktivita bez peroxidu“ alebo NPA, bola napokon odhalená v roku 2008, keď dve laboratóriá nezávisle identifikovali metylglyoxal (MGO) v mede Manuka (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008). MGO vzniká spontánnou dehydratáciou svojho prekurzora dihydroxyacetónu (DHA), prirodzene sa vyskytujúcej fytochemickej látky nachádzajúcej sa v nektári kvetov druhov Leptospermum scoparium, Leptospermum polygalifolium a niektorých príbuzných druhov rodu Leptospermum, pôvodných na Novom Zélande a v Austrálii (Adams et al., 2009; Williams et al., 2014; Norton et al., 2015). MGO môže pomerne nešpecificky reagovať s makromolekulami, ako sú DNA, RNA a bielkoviny (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008; Majtan et al., 2014b) a teoreticky by mohol byť toxický pre bunky cicavcov (Kalapos, 2008). Neexistujú však dôkazy o poškodení hostiteľských buniek pri perorálnej konzumácii medu Manuka ani pri jeho použití na ošetrenie rán; naopak, zdá sa, že med pri aplikácii na rany podporuje hojenie a znižuje tvorbu jaziev (Biglari et al., 2013; Majtan, 2014; Dart et al., 2015). Nie je známe, ako vyvoláva túto zdanlivo selektívnu toxicitu voči bakteriálnym bunkám.

Vysoké hladiny MGO alebo peroxidu vodíka zvyčajne vedú k najaktívnejšiemu medu, korelácia však nie je vždy dokonalá, čo naznačuje, že aktivitu môžu modulovať aj ďalšie zložky medu (Molan, 2008; Kwakman et al., 2011; Chen et al., 2012; Lu et al., 2013). Včelí defenzín-1, antimikrobiálny peptid pochádzajúci od včiel, je zodpovedný za aktivitu medu Revamil, aktívneho medu vyrábaného z nezverejneného zdroja, v manukovom mede však zrejme dochádza k jeho štrukturálnej úprave a strate aktivity (Kwakman et al., 2011; Majtan et al., 2012). Hladina leptozínu, glykozidu nachádzajúceho sa výlučne v mede z rodu Leptospermum, koreluje s účinnosťou a môže modulovať antimikrobiálnu aktivitu manukového medu (Kato et al., 2012). Podobne môžu byť prítomné rôzne fenolové zlúčeniny s potenciálnou antimikrobiálnou aktivitou, najmä v tmavšie sfarbených medoch, a hoci sa vyskytujú v množstvách, ktoré pravdepodobne samy osebe nepôsobia inhibične, môžu navzájom alebo s inými zložkami medu pôsobiť synergicky a vytvárať či meniť aktivitu (Estevinho et al., 2008; Stephens et al., 2010). Fenolové zlúčeniny môžu pôsobiť aj ako antioxidanty a môžu byť zodpovedné za protizápalové vlastnosti medu a jeho vlastnosti podporujúce hojenie rán (Stephens et al., 2010). Treba poznamenať, že nie všetky druhy rodu Leptospermum produkujú aktívny med a dokonca aj v mede z druhov L. scoparium a L. polygalifolium sa hladiny MGO môžu pohybovať približne od 100 do >1200 ppm (Windsor et al., 2012). Prieskum aktivity austrálskeho medu zistil, že med pochádzajúci z rastlín rodu Leptospermum rastúcich v okolí hranice medzi Novým Južným Walesom a Queenslandom bol mimoriadne aktívny, nie je však známe, či je to spôsobené rastlinou, pôdou, podnebím alebo inými faktormi (Irish et al., 2011).

Inhibícia patogénov medom

Med bol testovaný in vitro na širokom spektre patogénov, najmä na tých, ktoré môžu kolonizovať pokožku, rany a sliznice, kde je možná lokálna liečba medom. Doterajšie testy in vitro ukázali, že Manuka med dokáže účinne inhibovať všetky testované problematické bakteriálne patogény (zhrnuté v tabuľke 1). Mimoriadne významné je, že klinické izoláty s fenotypmi multirezistencie voči liekom (MDR) nevykazujú zníženú citlivosť na med, čo naznačuje široké spektrum účinku odlišné od akéhokoľvek známeho antimikrobiálneho činidla (Willix et al., 1992; Blair and Carter, 2005; George and Cutting, 2007; Tan et al., 2009). Okrem toho sa v laboratóriu nepodarilo vytvoriť kmene odolné voči medu a neboli zaznamenané žiadne prípady klinických izolátov so získanou odolnosťou voči medu (Blair et al., 2009; Cooper et al., 2010).

Okrem inhibície planktonických buniek dokáže med rozrušovať biofilmy a usmrcovať baktérie, ktoré v nich žijú. Biofilmy sú spoločenstvá buniek, ktoré sú vo všeobecnosti obalené vlastnoručne vytvorenou extracelulárnou matrix a nachádzajú sa prichytené na povrchoch vrátane rán, zubov, slizníc a implantovaných zdravotníckych pomôcok. Mikroorganizmy žijúce v biofilmoch sú chránené pred antimikrobiálnymi látkami a môžu spôsobovať pretrvávajúce infekcie, ktoré neustupujú. Med Manuka narúša bunkové agregáty (Maddocks et al., 2012; Roberts et al., 2012) a zabraňuje tvorbe biofilmov širokým spektrom problematických patogénov vrátane druhov Streptococcus a Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii a Klebsiella pneumonia (Maddocks et al., 2012, 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a; Halstead et al., 2016). Dôležité je, že med dokáže narúšať aj už vytvorené biofilmy a usmrcovať bunky, ktoré v nich žijú, hoci v porovnaní s planktonickými bunkami je potrebná vyššia koncentrácia (Okhiria et al., 2009; Maddocks et al., 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a). Veľmi nedávno bol med Manuka testovaný na biofilme s viacerými druhmi obsahujúcom Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa a Enterococcus faecalis a zistilo sa, že znižuje životaschopnosť všetkých druhov okrem E. faecalis, ktorý sa nepodarilo eradikovať (Sojka et al., 2016). To má jasné klinické dôsledky pre používanie medu na rany obsahujúce biofilmy a pochopenie toho, ako biofilm umožňuje baktérii E. faecalis prežiť, hoci ju med za bežných okolností usmrcuje, predstavuje dôležitú a zaujímavú oblasť budúceho výskumu. Zdá sa, že MGO je za inhibíciu biofilmov medom Manuka zodpovedný z väčšej časti, nie však úplne, čo opäť zdôrazňuje význam ďalších zložiek, ktoré modulujú jeho účinok (Kilty et al., 2011; Lu et al., 2014).

Spektrum účinku medu proti nebakteriálnym patogénom zatiaľ nie je dostatočne známe. Nedávne štúdie skúmajúce antivírusový účinok medu Manuka naznačujú jeho potenciál pri liečbe vírusu varicella-zoster (pôvodcu ovčích kiahní a pásového oparu) (Shahzad and Cohrs, 2012) a chrípky (Watanabe et al., 2014). Kožné hubové patogény vrátane Candida albicans a druhov dermatofytov sú voči medu Manuka podstatne menej citlivé než baktérie, no med s vysokou mierou tvorby peroxidu vodíka ich inhibuje (Brady et al., 1996; Irish et al., 2006). Zistilo sa, že med Manuka aj iný med znižujú životaschopnosť spór mikrosporídie Nosema apis, významného patogénu včiel, no med nedokázal vyliečiť infekciu včiel po jej prepuknutí (Malone et al., 2001). Použitiu medu proti prvokom alebo helmintom sa venovalo len veľmi málo štúdií a v týchto štúdiách sa nepoužil med s dobre charakterizovanou účinnosťou, čo sťažuje posúdenie významu ich zistení (Bassam et al., 1997; Nilforoushzadeh et al., 2007; Sajid and Azim, 2012).

Zaradenie medu do bežnej medicíny: Nedávne experimentálne a mechanistické štúdie objasňujú, ako med účinkuje

Aktívny manukový med je široko dostupný ako terapeutický prostriedok a funkčná potravina a väčšina spotrebiteľov ho vníma ako holistický, do istej miery záhadný produkt. Nedostatočné pochopenie toho, ako med ničí baktérie a podporuje hojenie, však obmedzuje jeho prijatie v rámci konvenčnej medicíny, kde sa stále považuje za „alternatívny“ alebo „doplnkový“. Drvivá väčšina doterajších výskumných štúdií o mede bola opisná, no novšie štúdie sa pokúšajú objasniť, ako med funguje, a využívajú mechanistické prístupy na určenie toho, ako pôsobí na bunkovej a molekulárnej úrovni.

Ultrastrukturálne štúdie bakteriálnych buniek a spoločenstiev ošetrených medom

Med môže výrazne meniť veľkosť a tvar bakteriálnych buniek, hoci rozsah týchto zmien sa medzi rôznymi druhmi baktérií líši. Pomocou transmisnej elektrónovej mikroskopie (TEM) sa v kultúrach S. aureus ošetrených manukovým medom nachádzalo viac buniek s dokončenými priečnymi prepážkami než v kultúrach ošetrených umelým medom, čo naznačuje, že bunky vstúpili do fázy delenia, ale nedokončili ju, hoci navonok sa tieto bunky pri skenovacej elektrónovej mikroskopii (SEM) javili ako normálne (Henriques et al., 2010). Novšie zobrazovanie vo fázovom kontraste po ošetrení subletálnou dávkou manukového medu ukázalo, že bunky S. aureus a Bacillus subtilis boli výrazne menšie a mali väčšiu pravdepodobnosť kondenzovanej DNA než bunky rastúce bez medu (Lu et al., 2013). Tieto štúdie sa ťažko priamo porovnávajú, pretože použili rôzne množstvá medu a rôzne časy pôsobenia, celkové výsledky však naznačujú oddelenie rastu od delenia buniek, ktoré sa často pozoruje v reakcii na nutričný a environmentálny stres (Silva-Rocha and de Lorenzo, 2010).

Uvádza sa, že ošetrenie medom spôsobuje, že kultúry gramnegatívnych druhov E. coli a P. aeruginosa majú abnormálne kratšie aj dlhšie bunky (Lu et al., 2013). Je zaujímavé, že hoci sa zdá, že P. aeruginosa je voči inhibícii medom menej citlivá než iné druhy, pomocou TEM a SEM sa pozorovali výrazné bunkové zmeny vrátane rýh a pľuzgierov (výčnelkov bunkových plazmatických membrán) na povrchu buniek a značného množstva extracelulárnych zvyškov poukazujúcich na lýzu buniek (Henriques et al., 2011). Následná štúdia s použitím fluorescenčného farbenia BacLight na živé a mŕtve bunky a konfokálnej mikroskopie to potvrdila, zároveň však ukázala, že zostal pomerne veľký počet živých buniek. V týchto štúdiách sa použil 20 % (w/v) med, čo bolo viac než MBC pre daný kmeň P. aeruginosa, takže sa očakávala výrazná inhibícia a odumieranie. Atómová silová mikroskopia (AFM) však aj pri subbaktericídnych koncentráciách odhalila výraznú deformáciu buniek a tvorbu pľuzgierov v bunkách ošetrených koncentráciami zodpovedajúcimi MIC (12 %) a polovici MIC (6 %), spolu so značnou lýzou buniek (Roberts et al., 2012). Túto zjavnú degeneráciu buniek P. aeruginosa podporila kvantitatívna analýza PCR, ktorá v bunkách ošetrených medom preukázala 10-násobnú downreguláciu génu oprF, kódujúceho porín vonkajšej membrány dôležitý pre štrukturálnu stabilitu (Jenkins et al., 2015a).

„Omické analýzy hodnotia celobunkovú odpoveď na inhibíciu medom

Možnosť hodnotiť výstupy celej bunky priniesla revolúciu do štúdia interakcií medzi liekmi a patogénmi a má osobitnú hodnotu pri komplexných prírodných produktoch, ako je med, pri ktorých sú pravdepodobné účinky na viacero procesov. Mikroštúdie a proteomické štúdie baktérií vystavených medu naznačili aktiváciu procesov súvisiacich so stresom a potlačenie syntézy bielkovín (Blair et al., 2009; Jenkins et al., 2011; Packer et al., 2012). Hoci je to celkovo pomerne typická odpoveď na inhibičné látky, med vyvolal jedinečný „podpis“ diferenciálnej expresie, ktorý zahŕňal mnohé bielkoviny s hypotetickými alebo neznámymi funkciami, čo naznačuje nový mechanizmus účinku. Špecifické gény alebo bielkoviny, pri ktorých sa v analýzach „omík“ zistila znížená regulácia u S. aureus a E. coli O157/H7, súvisia s virulenciou, quorum sensingom a tvorbou biofilmu (Lee et al., 2011; Jenkins et al., 2013), pričom u P. aeruginosa sa zistila znížená regulácia bielkovín zapojených do tvorby bičíkov (Roberts et al., 2015). Tieto fenotypy sú pre patogény kľúčové pri kolonizácii a vyvolaní invazívnej infekcie a naznačujú, že med okrem inhibície rastu môže znižovať aj patogénny potenciál infikujúcich baktérií.

Hoci sú analýzy „omík“ uskutočnené doteraz stále pomerne obmedzené počtom aj rozsahom, naznačujú komplexnú bunkovú odpoveď na med s výraznými rozdielmi medzi jednotlivými bakteriálnymi druhmi. Na objasnenie tejto komplexnosti sú teraz potrebné pokročilé prístupy systémovej biológie, ktoré umožnia zasadiť údaje do kontextu, ako aj validačné štúdie využívajúce kvantitatívnu PCR a kmene s deléciou génov; tie môžu odhaliť nové prístupy k liekovým terapiám zameraným na inhibíciu rastu baktérií (Hudson et al., 2012).

Interakcie medzi medom a konvenčnými antibiotikami

Okrem použitia ako samostatného prostriedku existuje priestor na využitie medu na podporu liečby konvenčnými antibiotikami. Osobitnú hodnotu to môže mať v kombinácii so systémovými látkami, ktoré sa môžu do spodiny rany dostať krvným obehom, zatiaľ čo med sa aplikuje lokálne. Kombinovaná liečba môže tiež znížiť terapeutickú dávku antimikrobiálnych látok a zabrániť vzniku rezistencie; v niektorých prípadoch môže viesť k synergickému účinku liekov, pri ktorom je kombinovaná aktivita väčšia než súčet jednotlivých aktivít oboch liekov.

In vitro štúdie kombinujúce terapeuticky schválený Manuka med s antibiotikami preukázali synergický účinok oxacilínu, tetracyklínu, imipenému a mupirocínu proti rastu kmeňa MRSA (Jenkins and Cooper, 2012). Prítomnosť subinhibičnej koncentrácie medu v kombinácii s oxacilínom navyše obnovila citlivosť kmeňa MRSA na oxacilín. Autori zistili zníženú reguláciu mecR1, ktorý kóduje penicilín viažuci proteín špecifický pre MRSA (PBP2A), a navrhli, že by to mohlo byť mechanizmom synergického účinku medu. Zistil sa aj výrazný synergický účinok Manuka medu a rifampicínu proti viacerým kmeňom S. aureus vrátane klinických izolátov a kmeňov MRSA; prítomnosť medu zároveň zabránila vzniku rezistencie na rifampicín in vitro (Müller et al., 2013). Má to klinický význam, pretože rifampicín dobre preniká do tkanív a abscesov a bežne sa používa na liečbu povrchových stafylokokových infekcií, no rýchlo vyvoláva rezistenciu, a preto sa musí používať v kombinácii s inou látkou. Ďalším zistením tejto štúdie bolo, že synergický účinok nebol spôsobený MGO, pretože syntetický med obohatený o MGO nevykazoval synergický účinok s rifampicínom.

Pochopenie toho, ako med ovplyvňuje účinok antimikrobiálnych látok s dobre charakterizovanými mechanizmami účinku, môže tiež prehĺbiť naše poznatky o tom, ako med pôsobí na bakteriálne patogény. Liu et al. (2014)rozšírili analýzu synergického účinku o ďalšie antibiotiká a rôzne kmene S. aureus a MRSA. Navrhli, že zvýšená citlivosť na klindamycín a gentamicín môže byť výsledkom kombinovaného účinku medom zníženej syntézy bielkovín a antibiotikami vyvolanej inhibície ribozómov, zatiaľ čo synergický účinok s β-laktámovými antibiotikami môže byť spôsobený zvýšeným oxidačným stresom vyvolaným oboma zložkami. Keďže kmene S. aureus a MRSA boli rovnako citlivé na kombináciu oxacilínu a medu, zdalo sa, že synergický účinok pravdepodobne nebol spôsobený zníženou reguláciou PBP2A. V jednom klinickom izoláte MRSA však prítomnosť medu nezvýšila citlivosť na klindamycín ani gentamicín, čo je pozoruhodné, pretože ide o prvý opísaný prípad rozdielnej reakcie MRSA a S. aureus na med. Skúmanie tohto rozdielu špecifického pre daný kmeň pomocou transkriptomických alebo proteomických analýz by bolo zaujímavým smerom budúceho výskumu (Liu et al., 2014).

Dôkazy účinnosti zo štúdií na zvieratách, kazuistík a klinických skúšaní

Spoločnosti, ktoré vyrábajú a uvádzajú na trh med Manuka, presadzujú vysoké etické štandardy a neodporúčajú používanie zvieracích modelov na skúmanie infekcií a hojenia rán. Med Manuka sa však používal na liečbu zvierat s chirurgickými alebo náhodnými ranami, najmä koní, s pozitívnymi výsledkami (Dart et al., 2015; Bischofberger et al., 2016). Kazuistiky použitia medu pri nehojacich sa ranách a vredoch zaznamenali výrazné zlepšenie a ústup infekcie v prípadoch, keď konvenčné antibiotiká zlyhali (Regulski, 2008; Smith et al., 2009). Napriek tomu a dôkazom z mnohých modelov in vitro a in vivo, že med usmrcuje problematické patogény rán, je robustných klinických údajov o mede Manuka nedostatok. Existujú na to rôzne dôvody vrátane technických ťažkostí pri vykonávaní dvojito zaslepenej, placebom kontrolovanej štúdie s takou charakteristickou látkou, akou je med, etických hľadísk, nezáujmu klinických pracovníkov a pomeru nákladov a prínosov pre medárske spoločnosti, ktoré sa zameriavajú na prírodné produkty a voľnopredajný predaj, pričom med Manuka a súvisiace obväzy už majú prémiovú cenu. To sa môže zmeniť s tým, ako antibiotická rezistencia oslabuje súčasné možnosti liečby a pokračujúci výskum upozorňuje na potenciál medu, čím sa dostáva do pozornosti zdravotníckych pracovníkov.

Nedostatky a nové príležitosti vo výskume medu

V poslednom období sme výrazne pokročili v chápaní terapeutického medu, jeho používanie v klinickej medicíne však zostáva obmedzené, dokonca aj vtedy, keď konvenčné antibiotiká začínajú zlyhávať. Zložitosť medu, ktorá je pravdepodobne jeho najväčšou prednosťou pri usmrcovaní rôznorodých patogénov a predchádzaní rezistencii, komplikuje jeho skúmanie, keďže aktivitu pravdepodobne ovplyvňuje mnoho faktorov pôsobiacich spoločne. Podporujeme ďalšie mechanistické štúdie s použitím vhodne registrovaného terapeutického medu Manuka, najmä štúdie využívajúce neredukcionistické prístupy systémovej biológie spolu s podrobnými chemickými a mikrobiologickými analýzami, ktoré objasnia, ako med pôsobí na molekulárnej, bunkovej a populačnej úrovni, ako sa to môže líšiť medzi rôznymi kmeňmi a druhmi mikrobiálnych patogénov a ako reaguje hostiteľská bunka (tabuľka 2). Informácie získané z týchto štúdií môžu následne pomôcť pri liečbe a poskytnúť klinické údaje potrebné na začlenenie medu do bežnej medicíny; už nie ako alternatívnej liečby používanej iba vtedy, keď všetko ostatné zlyhalo.

Príspevky autorov

Túto recenziu napísali DC, SB, NNC, DB a PB a kriticky ju posúdili RS a EH.

Financovanie

NNC dostáva platovú podporu od Rural Industries Research and Development Corporation – programu Honey Bee (grant PRJ-009186).

Vyhlásenie o konflikte záujmov

DC, PB a EH uvádzajú finančnú podporu vo forme platu a nefinančnú podporu v podobe manukového medu od spoločností Comvita NZ Limited a Capilano Honey Limited; RS je zamestnancom spoločnosti Comvita NZ Limited, ktorá obchoduje s manukovým medom medicínskej kvality (Medihoney).

Ostatní autori vyhlasujú, že výskum sa uskutočnil bez akéhokoľvek obchodného alebo finančného vzťahu, ktorý by bolo možné považovať za potenciálny konflikt záujmov.

Skratka

ESBL, β-laktamáza so širokým spektrom účinku; MBC, minimálna baktericídna koncentrácia; MGO, metylglyoxal; MIC, minimálna inhibičná koncentrácia; MRSA, meticilín-rezistentný Staphylococcus aureus; MRSE, meticilín-rezistentný Staphylococcus epidermis; NPA, aktivita nezávislá od peroxidu; VRE, vankomycín-rezistentný Enterococcus.

Referencie