Miere terapeutică Manuka: Nu mai este atât de alternativă

Introducere

Mierea a fost folosită ca medicament de-a lungul istoriei omenirii. Una dintre cele mai comune și persistente utilizări terapeutice ale mierii a fost ca pansament pentru răni, aproape sigur datorită proprietăților sale antimicrobiene. Odată cu apariția antibioticelor foarte active în anii 1960, mierea a fost considerată o „substanță inutilă, dar inofensivă” (Soffer, 1976). Totuși, criza actuală și în creștere a rezistenței la antibiotice a redeschis interesul pentru utilizarea mierii, atât ca agent eficient în sine, cât și ca punct de plecare terapeutic pentru dezvoltarea unor noi metode de tratament. Mierea este de obicei obținută din nectarul florilor și produsă de albine, cel mai frecvent de albina europeană Apis mellifera, și este un amestec complex de zaharuri, aminoacizi, fenolici și alte substanțe. Tipurile de miere provenite din diferite plante înfloritoare variază substanțial în capacitatea lor de a ucide bacteriile, ceea ce a complicat literatura de specialitate și a făcut uneori dificilă reproducerea rezultatelor între diferite studii (Allen et al., 1991; Irish et al., 2011). Majoritatea studiilor recente care investighează mecanismul de acțiune al mierii s-au concentrat pe mierea activă Manuka bine caracterizată și standardizată, produsă de anumite specii Leptospermum native din Noua Zeelandă și Australia, care a fost înregistrată ca produs pentru îngrijirea rănilor la organismele medicale de reglementare corespunzătoare. Astfel, dacă nu se specifică altfel, această recenzie se va concentra pe mierea Manuka.

Analize chimice ale mierii active Manuka

Profesorul Peter Molan de la Universitatea Waikato din Noua Zeelandă a fost primul care a raportat activitatea neobișnuită a mierii de Manuka și a început să testeze acțiunea acesteia împotriva unei game largi de specii bacteriene la mijlocul anilor 1980. Cu toate acestea, deși era clar că chiar și concentrațiile scăzute de miere de Manuka ucid agenții patogeni bacterieni, ingredientul activ specific responsabil pentru acest efect a rămas evaziv mulți ani. Conținutul ridicat de zahăr și pH-ul scăzut fac ca mierea să inhibe creșterea microbiană, dar activitatea persistă chiar și atunci când acestea sunt diluate la niveluri neglijabile. Multe tipuri de miere produc, de asemenea, peroxid de hidrogen atunci când glucozo oxidaza, derivată din albinele de miere, reacționează cu glucoza și apa. Totuși, în mierea de Manuka producția de peroxid de hidrogen este relativ scăzută și poate fi neutralizată de catalază, dar activitatea rămâne în continuare. Cauza acestei activități reziduale, denumită „activitate non-peroxidică” sau NPA, a fost în cele din urmă dezvăluită în 2008, când două laboratoare au identificat independent metilglioxalul (MGO) în mierea de Manuka (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008). MGO rezultă din deshidratarea spontană a precursorului său dihidroxiacetonă (DHA), un fitochimic natural care se găsește în nectarul florilor de Leptospermum scoparium, Leptospermum polygalifolium și unele specii înrudite de Leptospermum native din Noua Zeelandă și Australia (Adams et al., 2009; Williams et al., 2014; Norton et al., 2015). MGO poate reacționa relativ nespecific cu macromolecule precum ADN, ARN și proteine (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008; Majtan et al., 2014b) și teoretic ar putea fi toxic pentru celulele mamiferelor (Kalapos, 2008). Totuși, nu există dovezi de deteriorare a celulelor gazdă atunci când mierea de Manuka este consumată oral sau utilizată ca pansament pentru răni; de fapt, mierea pare să stimuleze vindecarea și să reducă cicatrizarea când este aplicată pe răni (Biglari et al., 2013; Majtan, 2014; Dart et al., 2015). Modul în care exercită această toxicitate aparent selectivă asupra celulelor bacteriene nu este cunoscut.

Nivelurile ridicate de MGO sau peroxid de hidrogen produc de obicei cel mai activ miere, totuși corelația nu este întotdeauna perfectă, sugerând că alte componente ale mierii pot modula activitatea (Molan, 2008; Kwakman et al., 2011; Chen et al., 2012; Lu et al., 2013). Defensina-1 a albinelor, un peptid antimicrobian derivat de la albine, este responsabilă pentru activitatea mierii Revamil, o miere activă produsă dintr-o sursă nedezvăluită, dar aceasta pare a fi modificată structural și inactivă în mierea Manuka (Kwakman et al., 2011; Majtan et al., 2012). Nivelul de leptosină, un glicozid găsit exclusiv în mierea Leptospermum, corelează cu potența și poate modula activitatea antimicrobiană a mierii Manuka (Kato et al., 2012). În mod similar, diferiți compuși fenolici cu potențială activitate antimicrobiană pot fi prezenți, în special în mierea de culoare mai închisă, și deși aceștia apar la niveluri care probabil nu sunt inhibitoare de unii singuri, pot acționa sinergic între ei sau cu alte componente ale mierii pentru a produce sau modifica activitatea (Estevinho et al., 2008; Stephens et al., 2010). Fenolii pot acționa și ca antioxidanți și pot fi responsabili pentru proprietățile antiinflamatorii și de vindecare a rănilor ale mierii (Stephens et al., 2010). Trebuie menționat că nu toate speciile de Leptospermum produc miere activă, iar chiar și în mierea de L. scoparium și L. polygalifolium, nivelurile de MGO pot varia de la ∼100 la >1200 ppm (Windsor et al., 2012). Un studiu privind activitatea mierii australiene a constatat că mierea provenită de la plantele Leptospermum care cresc în jurul graniței New South Wales–Queensland era deosebit de activă, dar dacă acest lucru se datorează plantei, solului, climei sau altor factori nu este cunoscut (Irish et al., 2011).

Inhibiția patogenilor prin miere

Mierea a fost testată in vitro pe o gamă diversă de patogeni, în special cei care pot coloniza pielea, rănile și mucoasele, unde tratamentul topic cu miere este posibil. Până în prezent, testele in vitro au arătat că mierea de Manuka poate inhiba eficient toți patogenii bacterieni problematici testați (rezumat în Tabelul 1). Este deosebit de interesant faptul că izolatele clinice cu fenotipuri de rezistență multiplă la medicamente (MDR) nu prezintă o reducere a sensibilității la miere, indicând un spectru larg de acțiune care nu seamănă cu niciun alt agent antimicrobian cunoscut (Willix et al., 1992; Blair and Carter, 2005; George and Cutting, 2007; Tan et al., 2009). În plus, încercările de a genera tulpini rezistente la miere în laborator nu au avut succes și nu au fost raportate cazuri clinice de izolate cu rezistență dobândită la miere (Blair et al., 2009; Cooper et al., 2010).

Pe lângă inhibarea celulelor planctonice, mierea poate dispersa și ucide bacteriile care trăiesc în biofilme. Biofilmele sunt comunități de celule închise, în general, într-o matrice extracelulară auto-produsă și se găsesc aderente pe suprafețe, inclusiv răni, dinți, suprafețe mucoase și dispozitive implantate. Microbii rezidenți în biofilme sunt protejați de agenții antimicrobieni și pot cauza infecții persistente, nerezolvate. Mierea Manuka perturbă agregatele celulare (Maddocks et al., 2012; Roberts et al., 2012) și previne formarea biofilmelor de către o gamă largă de patogeni problematici, inclusiv specii de Streptococcus și Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii și Klebsiella pneumonia (Maddocks et al., 2012, 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a; Halstead et al., 2016). Este important că mierea poate, de asemenea, să distrugă biofilmele deja formate și să ucidă celulele rezidente, deși este necesară o concentrație mai mare decât pentru celulele planctonice (Okhiria et al., 2009; Maddocks et al., 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a). Foarte recent, mierea Manuka a fost testată pe un biofilm multispecific care conținea Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa și Enterococcus faecalis și s-a constatat că reduce viabilitatea tuturor speciilor, cu excepția E. faecalis, care nu a putut fi eradicată (Sojka et al., 2016). Acest lucru are implicații clinice clare pentru utilizarea mierii pe răni care conțin biofilme, iar înțelegerea modului în care biofilmul permite E. faecalis să supraviețuiască atunci când în mod normal este ucisă de miere este o zonă importantă și interesantă pentru studii viitoare. MGO pare să fie în mare parte, dar nu în totalitate, responsabil pentru inhibarea biofilmelor de către mierea Manuka, evidențiind din nou importanța componentelor suplimentare care modulează activitatea (Kilty et al., 2011; Lu et al., 2014).

Spectrul de activitate al mierii împotriva patogenilor non-bacterieni nu este încă bine stabilit. Studii recente care au examinat efectul antiviral al mierii Manuka au sugerat că aceasta are potențial în tratamentul virusului varicelo-zosterian (cauza varicelei și a zona zoster) (Shahzad și Cohrs, 2012) și al gripei (Watanabe et al., 2014). Patogenii fungici ai pielii, inclusiv Candida albicans și speciile dermatofite, sunt semnificativ mai puțin susceptibili decât bacteriile la mierea Manuka, dar sunt inhibați de mierea cu niveluri ridicate de producție a peroxidului de hidrogen (Brady et al., 1996; Irish et al., 2006). Mierea Manuka și cea non-Manuka au fost găsite a reduce viabilitatea sporilor microsporidianului Nosema apis, un patogen important al albinelor, dar mierea nu a putut vindeca infecția albinelor odată ce aceasta era instalată (Malone et al., 2001). Au existat foarte puține studii privind utilizarea mierii pentru paraziți protozoari sau helminti, iar acestea nu au folosit miere cu activitate bine caracterizată, ceea ce face dificilă evaluarea semnificației rezultatelor lor (Bassam et al., 1997; Nilforoushzadeh et al., 2007; Sajid și Azim, 2012).

Integrarea mierii în medicina convențională: Studii experimentale și mecanistice recente oferă clarificări asupra modului în care funcționează mierea

Mierea activă Manuka este disponibilă pe scară largă ca agent terapeutic și aliment funcțional, iar majoritatea consumatorilor o acceptă ca un produs holistic, oarecum misterios. Totuși, lipsa unei înțelegeri clare despre modul în care mierea ucide bacteriile și promovează vindecarea limitează acceptarea sa în medicina convențională, unde este încă considerată „alternativă” sau „complementară”. Majoritatea studiilor de până acum au fost descriptive, însă cercetările recente încearcă să descifreze modul de acțiune al mierii, folosind abordări mecaniciste pentru a determina cum acționează la nivel celular și molecular.

Studii ultrastructurale ale celulelor și comunităților bacteriene tratate cu miere

Mierea poate modifica profund dimensiunea și forma celulelor bacteriene, deși gradul acestei modificări variază în funcție de speciile bacteriene. Folosind microscopie electronică în transmisie (TEM), culturile de S. aureus tratate cu miere Manuka aveau mai multe celule cu septuri complet formate comparativ cu cele tratate cu miere artificială, sugerând că celulele au intrat, dar nu au reușit să finalizeze etapa de diviziune a ciclului celular, deși extern aceste celule păreau normale la microscopie electronică de scanare (SEM) (Henriques et al., 2010). Mai recent, imagistica în contrast de fază după tratamentul cu o doză subletală de miere Manuka a arătat că celulele de S. aureus și Bacillus subtilis erau semnificativ mai mici și aveau mai frecvent ADN condensat decât cele crescute fără miere (Lu et al., 2013). Este dificil să comparăm direct aceste studii deoarece au folosit cantități diferite de miere și perioade de tratament diferite, dar în ansamblu rezultatele sugerează o decuplare între creștere și diviziunea celulară, fenomen adesea observat ca răspuns la stresuri nutriționale și de mediu (Silva-Rocha și de Lorenzo, 2010).

Tratamentul cu miere a fost raportat că determină culturile speciilor Gram-negative E. coli și P. aeruginosa să aibă celule atât anormal de scurte, cât și mai lungi (Lu et al., 2013). Interesant, deși P. aeruginosa pare să fie mai puțin susceptibilă la inhibiția prin miere decât alte specii, au fost observate modificări celulare profunde folosind TEM și SEM, inclusiv șanțuri și vezicule (proeminențe ale membranei plasmatice celulare) pe suprafața celulei și o cantitate substanțială de resturi extracelulare indicând liză celulară (Henriques et al., 2011). Acest lucru a fost confirmat într-un studiu ulterior folosind colorarea fluorescentă BacLight live-dead și microscopie confocală, deși s-a demonstrat că un număr relativ mare de celule vii au rămas. Aceste studii au folosit 20% (g/v) miere, ceea ce era mai mult decât MBC pentru tulpina lor de P. aeruginosa și s-ar fi așteptat inhibiție și moarte substanțială. Totuși, microscopia cu forță atomică (AFM) folosind niveluri sub-bactericide a găsit totuși distorsiuni celulare substanțiale și veziculare în celulele tratate cu concentrații MIC (12%) și jumătate MIC (6%), împreună cu liză celulară substanțială (Roberts et al., 2012). Această degenerare aparentă a celulei P. aeruginosa a fost susținută de analiza PCR cantitativă care a arătat o reglare în jos de 10 ori în celulele tratate cu miere a genei oprF, care codifică o porină a membranei exterioare importantă pentru stabilitatea structurală (Jenkins et al., 2015a).

Analizele ‘Omics evaluează răspunsul întregii celule la inhibiția prin miere

Capacitatea de a evalua rezultatele întregii celule a revoluționat studiul interacțiunilor dintre medicamente și patogeni și are o valoare deosebită pentru produse naturale complexe precum mierea, unde sunt probabile efecte asupra mai multor procese. Studiile microarray și proteomice ale bacteriilor expuse la miere au sugerat inducerea proceselor legate de stres și suprimarea sintezei proteice (Blair et al., 2009; Jenkins et al., 2011; Packer et al., 2012). Deși în general acest lucru este destul de tipic pentru un răspuns la agenți inhibitori, mierea a produs o „semnătură” unică de expresie diferențială care a inclus multe proteine cu funcții ipotetice sau necunoscute, sugerând un mod de acțiune nou. Gene sau proteine specifice găsite a fi reglate negativ în analizele ‘omics ale S. aureus și E. coli O157/H7 au funcții legate de virulență, detecția populației și formarea biofilmului (Lee et al., 2011; Jenkins et al., 2013), iar în P. aeruginosa a fost observată o reglare negativă a proteinelor implicate în flagelare (Roberts et al., 2015). Aceste fenotipuri sunt critice pentru ca patogenii să se stabilească și să producă infecții invazive și indică faptul că, pe lângă inhibarea creșterii, mierea poate reduce potențialul patogen al bacteriilor infectante.

Deși încă relativ limitate ca număr și amploare, analizele ‘omics efectuate până în prezent sugerează un răspuns celular complex la miere, cu variații considerabile între diferite specii bacteriene. Sunt necesare acum abordări avansate de biologie sistemică care să permită contextualizarea datelor și studii de validare folosind PCR cantitativ și tulpini cu gene șterse, pentru a descifra această complexitate, iar acestea pot dezvălui noi abordări pentru terapiile medicamentoase menite să inhibe creșterea bacteriană (Hudson et al., 2012).

Interacțiuni între miere și antibioticele convenționale

Pe lângă utilizarea ca agent unic, există posibilitatea de a folosi mierea pentru a completa tratamentul cu antibiotice convenționale. Acest lucru poate avea o valoare deosebită atunci când este combinat cu agenți sistemici care pot fi livrați la patul plăgii prin circulația sanguină, în timp ce mierea este aplicată topic. Tratamentele combinate pot reduce, de asemenea, doza terapeutică a agenților antimicrobieni și pot preveni dezvoltarea rezistenței, iar în unele cazuri pot duce la sinergie medicamentoasă, unde activitatea combinată este mai mare decât suma activităților individuale ale fiecărui partener de medicament.

Studiile in vitro care combină mierea de manuka aprobată terapeutic cu agenți antibiotici au descoperit un efect sinergic cu oxacilină, tetraciclină, imipenem și mupirocin împotriva creșterii unei tulpini MRSA (Jenkins și Cooper, 2012). Mai mult, prezența unei concentrații sub-inhibitoare de miere în combinație cu oxacilina a restabilit susceptibilitatea tulpinii MRSA la oxacilină. Autorii au constatat reglarea în jos a mecR1, care codifică o proteină specifică MRSA legată de penicilină (PBP2A), și au sugerat acest mecanism ca fiind cauza sinergiei mierii. De asemenea, s-a găsit o activitate sinergică puternică între mierea de manuka și rifampicină împotriva mai multor tulpini de S. aureus, inclusiv izolate clinice și tulpini MRSA, iar prezența mierii a prevenit apariția rezistenței la rifampicină in vitro (Müller et al., 2013). Acest lucru este de importanță clinică deoarece rifampicina pătrunde bine în țesuturi și abcese și este folosită frecvent pentru tratarea infecțiilor stafilococice superficiale, dar induce rapid rezistență și trebuie folosită în combinație cu un alt agent. O constatare suplimentară a acestui studiu a fost că sinergia nu se datorează MGO, deoarece o miere sintetică îmbogățită cu MGO nu a fost sinergică cu rifampicina.

Înțelegerea modului în care mierea afectează acțiunea antimicrobienilor cu moduri de acțiune bine caracterizate poate, de asemenea, să ne ajute să înțelegem cum mierea afectează agenții patogeni bacterieni. Liu et al. (2014) au extins analiza sinergiei pentru a include antibiotice suplimentare și diferite tulpini de S. aureus și MRSA. Ei au sugerat că o susceptibilitate crescută la clindamicină și gentamicină ar putea rezulta din efectul combinat al sintezei proteice reduse de către miere și inhibiția ribozomilor de către antibiotice, în timp ce sinergia cu antibioticele β-lactamice ar putea fi cauzată de stresul oxidativ crescut generat de ambii parteneri. Deoarece tulpinile de S. aureus și MRSA au fost la fel de susceptibile la combinația oxacilină-miere, părea că sinergia nu se datorează reglării în jos a PBP2A. Totuși, într-un izolat clinic MRSA, nu s-a observat o creștere a sensibilității la clindamicină sau gentamicină în prezența mierii, ceea ce este notabil deoarece este primul caz raportat de diferență în răspunsul la miere între MRSA și S. aureus. Investigarea acestei diferențe specifice tulpinii prin analize transcriptomice sau proteomice ar fi o direcție interesantă pentru cercetări viitoare (Liu et al., 2014).

Dovezi ale eficacității din studii pe animale, rapoarte de caz și studii clinice

Companiile care produc și comercializează mierea Manuka promovează standarde etice ridicate și descurajează utilizarea modelelor animale pentru studierea infecțiilor și vindecarea rănilor. Totuși, mierea Manuka a fost folosită pentru tratarea animalelor cu răni chirurgicale sau accidentale, în special cai, cu rezultate pozitive (Dart et al., 2015; Bischofberger et al., 2016). Rapoartele de caz care au folosit mierea pentru răni și ulcere care nu se vindecau au notat o îmbunătățire semnificativă cu rezolvarea infecției acolo unde antibioticele convenționale au eșuat (Regulski, 2008; Smith et al., 2009). Cu toate acestea, în ciuda acestui fapt și a dovezilor din numeroase modele in vitro și in vivo că mierea ucide patogenii problemă ai rănilor, există o lipsă de date clinice solide pentru mierea Manuka. Există diverse motive pentru aceasta, inclusiv dificultăți tehnice în realizarea unui studiu dublu-orb controlat cu placebo pe o substanță distinctivă precum mierea, considerente etice, lipsa interesului din partea practicienilor clinici și raportul cost-beneficiu pentru companiile de miere, al căror focus este pe produse naturale și vânzări fără prescripție, unde mierea Manuka și pansamentele asociate au deja un preț premium. Aceste aspecte se pot schimba pe măsură ce rezistența la antibiotice erodează opțiunile actuale de tratament și cercetările continue evidențiază potențialul mierii, aducând-o în atenția practicienilor medicali.

Lacune și oportunități emergente în studiul mierii

S-au făcut progrese importante recent în înțelegerea mierii terapeutice, însă utilizarea sa în medicina clinică rămâne limitată, chiar și atunci când antibioticele convenționale încep să dea greș. Complexitatea mierii, care este probabil cea mai mare forță a sa în uciderea diverselor patogeni și prevenirea rezistenței, complică studiul acesteia deoarece mulți factori care acționează împreună afectează probabil activitatea. Susținem studii mecanistice suplimentare folosind miere terapeutică Manuka înregistrată corespunzător, în special studii care utilizează abordări de biologie sistemică non-reducționiste, împreună cu analize chimice și microbiologice detaliate pentru a elucida modul în care acționează mierea la nivel molecular, celular și de populație, cum poate diferi aceasta în diferite tulpini și specii de patogeni microbieni și cum răspunde celula gazdă (Tabel 2). Informațiile obținute din aceste studii pot apoi să informeze terapia și să producă datele clinice necesare pentru a integra mierea în medicina convențională; nu mai este o terapie alternativă folosită doar când toate celelalte opțiuni au eșuat.

Contribuțiile autorilor

Această recenzie a fost scrisă de DC, SB, NNC, DB și PB și a fost revizuită critic de RS și EH.

Finanțare

NNC primește sprijin salarial de la Rural Industries Research and Development Corporation – Honey Bee Program (Grant PRJ-009186).

Declarație privind conflictul de interese

DC, PB și EH raportează sprijin financiar și non-financiar sub formă de miere manuka de la Comvita NZ Limited și Capilano Honey Limited; RS este angajat al Comvita NZ Limited, care comercializează miere manuka de grad medical (Medihoney).

Restul autorilor declară că cercetarea a fost realizată în absența oricărei relații comerciale sau financiare care ar putea fi interpretată ca un potențial conflict de interese.

Abreviere

ESBL, β-lactamază cu spectru extins; MBC, concentrația bactericidă minimă; MGO, metil glioxal; MIC, concentrația inhibitorie minimă; MRSA, Staphylococcus aureus rezistent la meticilină; MRSE, Staphylococcus epidermis rezistent la meticilină; NPA, activitate non-peroxidică; VRE, Enterococcus rezistent la vancomicină.

Referințe