Terapeutyczny miód Manuka: już nie taki alternatywny

Wprowadzenie

Miód był używany jako lek przez całą historię ludzkości. Jednym z najczęstszych i najtrwalszych terapeutycznych zastosowań miodu było stosowanie go jako opatrunku na rany, niemal na pewno ze względu na jego właściwości przeciwdrobnoustrojowe. Wraz z pojawieniem się silnie działających antybiotyków w latach 60. XX wieku, miód został odrzucony jako „bezwartościowa, ale nieszkodliwa substancja” (Soffer, 1976). Jednak obecny i narastający kryzys oporności na antybiotyki wzbudził ponowne zainteresowanie stosowaniem miodu, zarówno jako skutecznego środka samodzielnego, jak i jako terapeutycznego wzoru do opracowywania nowych metod leczenia. Miód zwykle pochodzi z nektaru kwiatów i jest produkowany przez pszczoły, najczęściej europejską pszczołę miodną Apis mellifera, i jest złożoną mieszaniną cukrów, aminokwasów, fenoli i innych substancji. Rodzaje miodu pochodzące z różnych roślin kwitnących znacznie różnią się zdolnością do zabijania bakterii, co skomplikowało literaturę na temat miodu i czasami utrudniało powtarzalność wyników w różnych badaniach (Allen i in., 1991; Irish i in., 2011). Większość ostatnich badań dotyczących mechanizmu działania miodu koncentrowała się na dobrze scharakteryzowanym, standaryzowanym aktywnym miodzie Manuka produkowanym przez niektóre gatunki Leptospermum pochodzące z Nowej Zelandii i Australii, który został zarejestrowany jako produkt do pielęgnacji ran przez odpowiednie organy regulacyjne medyczne. Dlatego, o ile nie zaznaczono inaczej, niniejszy przegląd skupi się na miodzie Manuka.

Analizy chemiczne aktywnego miodu Manuka

Profesor Peter Molan z Uniwersytetu Waikato w Nowej Zelandii był pierwszym, który w połowie lat 80. XX wieku opisał niezwykłą aktywność miodu Manuka i rozpoczął badania jego działania przeciwko szerokiemu spektrum różnych gatunków bakterii. Choć było jasne, że nawet niskie stężenia miodu Manuka zabijają patogeny bakteryjne, przez wiele lat nie udało się ustalić, który składnik aktywny jest za to odpowiedzialny. Wysoka zawartość cukru i niskie pH sprawiają, że miód hamuje wzrost drobnoustrojów, ale aktywność ta utrzymuje się nawet po rozcieńczeniu tych czynników do poziomów nieistotnych. Wiele różnych rodzajów miodu wytwarza również nadtlenek wodoru, gdy glukozo-oksydaza, pochodząca od pszczoły miodnej, reaguje z glukozą i wodą. Jednak w miodzie Manuka produkcja nadtlenku wodoru jest stosunkowo niska i może być neutralizowana przez katalazę, a mimo to aktywność pozostaje. Przyczynę tej pozostałej aktywności, nazwanej „aktywnością nieperoksydową” lub NPA, odkryto dopiero w 2008 roku, gdy dwie niezależne laboratoria zidentyfikowały metylglioksal (MGO) w miodzie Manuka (Adams i in., 2008; Mavric i in., 2008). MGO powstaje w wyniku spontanicznej dehydratacji swojego prekursora dihydroksyaceton (DHA), naturalnie występującego związku fitochimicznego obecnego w nektarze kwiatów Leptospermum scoparium, Leptospermum polygalifolium oraz niektórych pokrewnych gatunków Leptospermum rodzimych dla Nowej Zelandii i Australii (Adams i in., 2009; Williams i in., 2014; Norton i in., 2015). MGO może reagować stosunkowo niespecyficznie z makrocząsteczkami takimi jak DNA, RNA i białka (Adams i in., 2008; Mavric i in., 2008; Majtan i in., 2014b) i teoretycznie mógłby być toksyczny dla komórek ssaków (Kalapos, 2008). Jednak nie ma dowodów na uszkodzenia komórek gospodarza podczas spożywania miodu Manuka doustnie lub stosowania go jako opatrunku na rany; wręcz przeciwnie, miód wydaje się stymulować gojenie i zmniejszać blizny po zastosowaniu na rany (Biglari i in., 2013; Majtan, 2014; Dart i in., 2015). Nie wiadomo, w jaki sposób miód Manuka wywiera tę pozornie selektywną toksyczność wobec komórek bakteryjnych.

Wysokie poziomy MGO lub nadtlenku wodoru zwykle dają najbardziej aktywny miód, jednak korelacja ta nie zawsze jest idealna, co sugeruje, że inne składniki miodu mogą modulować jego aktywność (Molan, 2008; Kwakman et al., 2011; Chen et al., 2012; Lu et al., 2013). Defensyna-1 pszczół, antybakteryjny peptyd pochodzący od pszczół, odpowiada za aktywność miodu Revamil, aktywnego miodu produkowanego z nieujawnionego źródła, ale wydaje się, że jest on strukturalnie zmodyfikowany i nieaktywny w miodzie Manuka (Kwakman et al., 2011; Majtan et al., 2012). Poziom leptozyny, glikozydu występującego wyłącznie w miodzie Leptospermum, koreluje z jego mocą i może modulować aktywność antybakteryjną miodu Manuka (Kato et al., 2012). Podobnie, różne związki fenolowe o potencjalnej aktywności antybakteryjnej mogą występować, szczególnie w ciemniejszych miodach, i chociaż ich poziomy są zbyt niskie, by działać samodzielnie hamująco, mogą one działać synergistycznie ze sobą lub z innymi składnikami miodu, wywołując lub zmieniając aktywność (Estevinho et al., 2008; Stephens et al., 2010). Fenole mogą również działać jako przeciwutleniacze i mogą odpowiadać za właściwości przeciwzapalne i wspomagające gojenie ran miodu (Stephens et al., 2010). Należy zauważyć, że nie wszystkie gatunki Leptospermum produkują aktywny miód, a nawet w miodach L. scoparium i L. polygalifolium poziomy MGO mogą wahać się od około 100 do ponad 1200 ppm (Windsor et al., 2012). Badanie aktywności australijskich miodów wykazało, że miód pochodzący z roślin Leptospermum rosnących w okolicach granicy Nowa Południowa Walia–Queensland był szczególnie aktywny, jednak nie wiadomo, czy jest to spowodowane rośliną, glebą, klimatem czy innymi czynnikami (Irish et al., 2011).

Hamowanie patogenów przez miód

Miód był testowany in vitro na różnorodnych patogenach, szczególnie tych, które mogą kolonizować skórę, rany i błony śluzowe, gdzie możliwe jest miejscowe stosowanie miodu. Do tej pory testy in vitro wykazały, że miód Manuka skutecznie hamuje wszystkie problematyczne patogeny bakteryjne poddane badaniom (podsumowano w Tabeli 1). Szczególnie interesujące jest to, że izolaty kliniczne o fenotypach wielolekooporności (MDR) nie wykazują zmniejszonej wrażliwości na miód, co wskazuje na szerokie spektrum działania, nieporównywalne z żadnym znanym środkiem przeciwbakteryjnym (Willix i in., 1992; Blair i Carter, 2005; George i Cutting, 2007; Tan i in., 2009). Ponadto próby wyhodowania szczepów opornych na miód w laboratorium nie powiodły się, a także nie odnotowano przypadków izolatu klinicznego z nabyta opornością na miód (Blair i in., 2009; Cooper i in., 2010).

Oprócz hamowania komórek planktonicznych, miód może rozpraszać i zabijać bakterie żyjące w biofilmach. Biofilmy to społeczności komórek zwykle otoczone samodzielnie wytwarzaną macierzą zewnątrzkomórkową i przyczepione do powierzchni, w tym ran, zębów, powierzchni śluzowych oraz wszczepionych urządzeń. Mikroorganizmy zamieszkujące biofilmy są chronione przed środkami przeciwdrobnoustrojowymi i mogą powodować przewlekłe, nierozwiązujące się infekcje. Miód Manuka rozbija agregaty komórkowe (Maddocks i in., 2012; Roberts i in., 2012) i zapobiega tworzeniu biofilmów przez szeroki zakres problematycznych patogenów, w tym gatunki Streptococcus i Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii oraz Klebsiella pneumonia (Maddocks i in., 2012, 2013; Lu i in., 2014; Majtan i in., 2014a; Halstead i in., 2016). Co ważne, miód może także rozbijać ustalone biofilmy i zabijać zamieszkujące je komórki, choć wymaga to wyższego stężenia niż w przypadku komórek planktonicznych (Okhiria i in., 2009; Maddocks i in., 2013; Lu i in., 2014; Majtan i in., 2014a). Bardzo niedawno miód Manuka był testowany na biofilmie wielogatunkowym zawierającym Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa oraz Enterococcus faecalis i stwierdzono, że zmniejsza żywotność wszystkich gatunków poza E. faecalis, którego nie udało się wyeliminować (Sojka i in., 2016). Ma to jasne implikacje kliniczne dla stosowania miodu na rany zawierające biofilmy, a zrozumienie, jak biofilm umożliwia przetrwanie E. faecalis, który normalnie jest zabijany przez miód, jest ważnym i interesującym obszarem przyszłych badań. MGO wydaje się być głównie, ale nie całkowicie odpowiedzialny za hamowanie biofilmów przez miód Manuka, co ponownie podkreśla znaczenie dodatkowych składników modulujących aktywność (Kilty i in., 2011; Lu i in., 2014).

Spektrum działania miodu wobec patogenów niebakteryjnych nie zostało jeszcze dobrze ustalone. Ostatnie badania dotyczące przeciwwirusowego działania miodu Manuka sugerują jego potencjał w leczeniu wirusa ospy wietrznej i półpaśca (varicella-zoster) (Shahzad i Cohrs, 2012) oraz grypy (Watanabe i in., 2014). Grzybicze patogeny skóry, w tym Candida albicans oraz gatunki dermatofitów, są znacznie mniej podatne na miód Manuka niż bakterie, ale są hamowane przez miód o wysokim poziomie produkcji nadtlenku wodoru (Brady i in., 1996; Irish i in., 2006). Stwierdzono, że miód Manuka i niemiód Manuka zmniejszają żywotność zarodników mikrosporidialnego Nosema apis, ważnego patogenu pszczół, jednak miód nie mógł wyleczyć zakażenia pszczół, gdy już się rozwinęło (Malone i in., 2001). Przeprowadzono bardzo niewiele badań nad zastosowaniem miodu wobec pasożytów pierwotniaków lub helmintów, a te badania nie wykorzystywały miodu o dobrze scharakteryzowanej aktywności, co utrudnia ocenę znaczenia ich wyników (Bassam i in., 1997; Nilforoushzadeh i in., 2007; Sajid i Azim, 2012).

Wprowadzenie miodu do medycyny głównego nurtu: Ostatnie badania eksperymentalne i mechanistyczne rzucają światło na działanie miodu

Aktywny miód Manuka jest szeroko dostępny jako środek terapeutyczny i żywność funkcjonalna, a większość konsumentów postrzega go jako holistyczny, nieco tajemniczy produkt. Jednak brak zrozumienia, jak miód zabija bakterie i wspomaga gojenie, ogranicza jego akceptację w medycynie konwencjonalnej, gdzie nadal jest uważany za „alternatywny” lub „uzupełniający”. Zdecydowana większość badań nad miodem do tej pory miała charakter opisowy, jednak ostatnie badania próbują rozwiązać mechanizmy działania miodu, stosując podejścia mechanistyczne, aby określić, jak działa na poziomie komórkowym i molekularnym.

Badania ultrastrukturalne komórek i społeczności bakteryjnych traktowanych miodem

Miód może znacząco zmieniać rozmiar i kształt komórek bakteryjnych, choć stopień tych zmian różni się w zależności od gatunku bakterii. Za pomocą transmisyjnej mikroskopii elektronowej (TEM) stwierdzono, że kultury S. aureus traktowane miodem Manuka miały więcej komórek z ukończonymi przegrodami w porównaniu z tymi traktowanymi sztucznym miodem, co sugeruje, że komórki weszły, ale nie ukończyły etapu podziału cyklu komórkowego, choć zewnętrznie komórki te wyglądały normalnie w mikroskopii skaningowej (SEM) (Henriques et al., 2010). Niedawno, obrazowanie kontrastem fazowym po zastosowaniu podśmiertelnej dawki miodu Manuka wykazało, że komórki S. aureus i Bacillus subtilis były znacznie mniejsze i częściej miały skondensowane DNA niż te rosnące bez miodu (Lu et al., 2013). Trudno bezpośrednio porównać te badania, ponieważ użyto różnych ilości miodu i czasów leczenia, ale ogólnie wyniki sugerują rozdzielenie wzrostu i podziału komórkowego, co często obserwuje się w odpowiedzi na stresy odżywcze i środowiskowe (Silva-Rocha and de Lorenzo, 2010).

Stosowanie miodu wykazano, że powoduje, iż kultury Gram-ujemnych gatunków E. coli i P. aeruginosa mają zarówno nieprawidłowo krótsze, jak i dłuższe komórki (Lu i in., 2013). Co ciekawe, choć P. aeruginosa wydaje się być mniej podatna na hamowanie przez miód niż inne gatunki, zaobserwowano głębokie zmiany komórkowe za pomocą TEM i SEM, w tym bruzdy i pęcherze (wypukłości błon plazmatycznych komórek) na powierzchni komórki oraz znaczną ilość zewnątrzkomórkowych szczątków wskazujących na lizie komórek (Henriques i in., 2011). Potwierdzono to w kolejnych badaniach z użyciem barwienia fluorescencyjnego BacLight live-dead i mikroskopii konfokalnej, choć wykazały one również, że stosunkowo duża liczba komórek pozostawała żywa. Badania te stosowały 20% (m/m) miód, co było wyższym stężeniem niż MBC dla ich szczepu P. aeruginosa i należało się spodziewać znacznego zahamowania wzrostu i śmierci. Jednak mikroskopia sił atomowych (AFM) przy podbakteriobójczych stężeniach nadal wykazała znaczne zniekształcenia komórek i pęcherze w komórkach traktowanych stężeniami MIC (12%) i połowy MIC (6%), wraz ze znaczną lizą komórek (Roberts i in., 2012). To pozorne uszkodzenie komórki P. aeruginosa potwierdziła analiza ilościowa PCR, która wykazała dziesięciokrotną redukcję ekspresji oprF w komórkach traktowanych miodem, kodującego porinę błony zewnętrznej ważną dla stabilności strukturalnej (Jenkins i in., 2015a).

Analizy „Omics” oceniają odpowiedź całej komórki na hamowanie przez miód

Możliwość oceny całkowitych efektów komórkowych zrewolucjonizowała badania interakcji lek-patogen i ma szczególne znaczenie dla złożonych produktów naturalnych, takich jak miód, gdzie prawdopodobne są efekty na wiele procesów. Badania mikroarray i proteomiczne bakterii narażonych na miód sugerowały indukcję procesów związanych ze stresem oraz hamowanie syntezy białek (Blair et al., 2009; Jenkins et al., 2011; Packer et al., 2012). Choć ogólnie jest to dość typowa odpowiedź na środki hamujące, miód wywołał unikalny „podpis” różnicowej ekspresji, który obejmował wiele białek o hipotetycznych lub nieznanych funkcjach, co sugeruje nowy mechanizm działania. Konkretne geny lub białka wykazujące obniżoną ekspresję w analizach ‘omics S. aureus i E. coli O157/H7 mają funkcje związane z wirulencją, quorum sensing i tworzeniem biofilmu (Lee et al., 2011; Jenkins et al., 2013), a w P. aeruginosa zaobserwowano obniżenie ekspresji białek zaangażowanych w wici (Roberts et al., 2015). Te fenotypy są kluczowe dla patogenów w ustanawianiu i wywoływaniu infekcji inwazyjnej i wskazują, że oprócz hamowania wzrostu, miód może zmniejszać potencjał patogenny zakażających bakterii.

Chociaż nadal stosunkowo ograniczone pod względem liczby i zakresu, analizy „omics” przeprowadzone do tej pory sugerują złożoną odpowiedź komórkową na miód z dużą zmiennością w różnych gatunkach bakterii. Zaawansowane podejścia biologii systemów, które pozwalają na kontekstualizację danych, oraz badania walidacyjne z użyciem ilościowego PCR i szczepów z delecją genów, są teraz potrzebne do rozwikłania tej złożoności, co może ujawnić nowe metody terapii lekowej ukierunkowanej na hamowanie wzrostu bakterii (Hudson et al., 2012).

Interakcje między miodem a konwencjonalnymi antybiotykami

Oprócz stosowania jako jedyny środek, istnieje możliwość użycia miodu do wspomagania leczenia konwencjonalnymi antybiotykami. Może to mieć szczególne znaczenie w połączeniu z lekami systemowymi, które mogą być dostarczane do rany przez krążenie krwi, podczas gdy miód jest stosowany miejscowo. Leczenie łączone może również obniżyć terapeutyczną dawkę środków przeciwdrobnoustrojowych i zapobiec rozwojowi oporności, a w niektórych przypadkach może prowadzić do synergii leków, gdzie łączna aktywność jest większa niż suma indywidualnych działań każdego z partnerów leku.

Badania in vitro łączące terapeutycznie zatwierdzony miód Manuka z antybiotykami wykazały efekt synergiczny z oksacyliną, tetracykliną, imipenemem i mupirocyną przeciwko wzrostowi szczepu MRSA (Jenkins i Cooper, 2012). Ponadto obecność subinhibicyjnego stężenia miodu w połączeniu z oksacyliną przywróciła wrażliwość szczepu MRSA na oksacylinę. Autorzy stwierdzili obniżenie ekspresji mecR1, kodującego specyficzne dla MRSA białko wiążące penicylinę (PBP2A), i zasugerowali to jako mechanizm synergii miodu. Silną aktywność synergiczną między miodem Manuka a ryfampicyną przeciwko wielu szczepom S. aureus, w tym izolatów klinicznych i szczepów MRSA, również wykazano, a obecność miodu zapobiegała powstawaniu oporności na ryfampicynę in vitro (Müller i in., 2013). Ma to znaczenie kliniczne, ponieważ ryfampicyna dobrze przenika do tkanek i ropni oraz jest powszechnie stosowana w leczeniu powierzchownych zakażeń gronkowcowych, ale szybko indukuje oporność, dlatego musi być stosowana w połączeniu z innym środkiem. Dodatkowym ustaleniem z tego badania było, że synergizm nie wynikał z MGO, ponieważ syntetyczny miód wzbogacony w MGO nie wykazywał synergii z ryfampicyną.

Zrozumienie, jak miód wpływa na działanie antybiotyków o dobrze scharakteryzowanych mechanizmach działania, może również pogłębić naszą wiedzę na temat wpływu miodu na patogeny bakteryjne. Liu i in. (2014) rozszerzyli analizę synergii o dodatkowe antybiotyki oraz różne szczepy S. aureus i MRSA. Sugerowali, że zwiększona wrażliwość na klindamycynę i gentamycynę może wynikać z łącznego efektu obniżonej syntezy białek przez miód oraz hamowania rybosomów przez antybiotyki, podczas gdy synergizm z antybiotykami β-laktamowymi mógł być spowodowany zwiększonym stresem oksydacyjnym wywołanym przez oba czynniki. Ponieważ szczepy S. aureus i MRSA były równie wrażliwe na połączenie oksacyliny z miodem, wydawało się, że synergizm nie wynika z obniżenia ekspresji PBP2A. Jednak w jednym klinicznym szczepie MRSA nie zaobserwowano zwiększonej wrażliwości na klindamycynę ani gentamycynę w obecności miodu, co jest istotne jako pierwszy zgłoszony przypadek różnicy w odpowiedzi na miód między MRSA a S. aureus. Badanie tej różnicy specyficznej dla szczepu za pomocą analiz transkryptomicznych lub proteomicznych byłoby interesującym kierunkiem przyszłych badań (Liu i in., 2014).

Dowody skuteczności z badań na zwierzętach, raportów przypadków i badań klinicznych

Firmy produkujące i sprzedające miód Manuka promują wysokie standardy etyczne i zniechęcają do stosowania modeli zwierzęcych w badaniach nad infekcjami i gojeniem ran. Miód Manuka był jednak stosowany do leczenia zwierząt z ranami chirurgicznymi lub przypadkowymi, szczególnie u koni, z pozytywnymi rezultatami (Dart et al., 2015; Bischofberger et al., 2016). Opisy przypadków stosowania miodu w leczeniu trudno gojących się ran i owrzodzeń odnotowały znaczną poprawę z ustąpieniem infekcji tam, gdzie zawiodły konwencjonalne antybiotyki (Regulski, 2008; Smith et al., 2009). Jednak pomimo tego oraz dowodów z licznych modeli in vitro i in vivo, że miód zabija problematyczne patogeny ran, brakuje solidnych danych klinicznych dotyczących miodu Manuka. Przyczyn jest wiele, w tym trudności techniczne w przeprowadzeniu podwójnie ślepego badania kontrolowanego placebo na charakterystycznej substancji, jaką jest miód, względy etyczne, brak zainteresowania ze strony praktyków klinicznych oraz stosunek kosztów do korzyści dla firm produkujących miód, które koncentrują się na produktach naturalnych i sprzedaży bez recepty, gdzie miód Manuka i powiązane opatrunki już osiągają cenę premium. Może się to zmienić wraz z narastającą opornością na antybiotyki, która ogranicza obecne opcje leczenia, oraz dzięki trwającym badaniom podkreślającym potencjał miodu, które zwracają na niego uwagę lekarzy.

Luki i nowe możliwości w badaniach nad miodem

Ostatnio poczyniono duże postępy w zrozumieniu terapeutycznego działania miodu, jednak jego zastosowanie w medycynie klinicznej pozostaje ograniczone, nawet gdy tradycyjne antybiotyki zaczynają zawodzić. Złożoność miodu, która jest jego największą siłą w zwalczaniu różnorodnych patogenów i zapobieganiu oporności, utrudnia jego badanie, ponieważ wiele czynników działających razem prawdopodobnie wpływa na jego aktywność. Opowiadamy się za dalszymi badaniami mechanistycznymi z użyciem odpowiednio zarejestrowanego terapeutycznego miodu Manuka, w szczególności badaniami wykorzystującymi nienależące do redukcjonistycznych podejścia systemowej biologii, wraz ze szczegółowymi analizami chemicznymi i mikrobiologicznymi, aby wyjaśnić, jak miód działa na poziomie molekularnym, komórkowym i populacyjnym, jak może się to różnić w różnych szczepach i gatunkach patogenów mikrobiologicznych oraz jak reaguje komórka gospodarza (Tabela 2). Informacje uzyskane z tych badań mogą następnie posłużyć do opracowania terapii i dostarczenia danych klinicznych niezbędnych do wprowadzenia miodu do medycyny konwencjonalnej; nie jako terapia alternatywna stosowana tylko wtedy, gdy wszystko inne zawiedzie.

Wkład autorów

Niniejszą recenzję napisali DC, SB, NNC, DB i PB, a krytycznie ocenili RS i EH.

Finansowanie

NNC otrzymuje wsparcie finansowe z Rural Industries Research and Development Corporation – Honey Bee Program (Grant PRJ-009186).

Oświadczenie o konflikcie interesów

DC, PB i EH otrzymują wsparcie finansowe i niefinansowe w postaci miodu manuka od Comvita NZ Limited i Capilano Honey Limited; RS jest zatrudniony w Comvita NZ Limited, która handluje medycznym miodem manuka (Medihoney).

Pozostali autorzy oświadczają, że badania przeprowadzono bez żadnych powiązań handlowych lub finansowych, które mogłyby być uznane za potencjalny konflikt interesów.

Skrót

ESBL, β-laktamazy o rozszerzonym spektrum działania; MBC, minimalne stężenie bakteriobójcze; MGO, metyloglioksal; MIC, minimalne stężenie hamujące; MRSA, metycylinooporny Staphylococcus aureus; MRSE, metycylinooporny Staphylococcus epidermis; NPA, aktywność nieperoksydowa; VRE, oporny na wankomycynę Enterococcus.

Bibliografia