Miele di Manuka Terapeutico: Non Più Così Alternativo

Introduzione

Il miele è stato usato come medicina nel corso della storia dell'umanità. Uno degli usi terapeutici più comuni e persistenti del miele è stato come medicazione per ferite, quasi certamente grazie alle sue proprietà antimicrobiche. Con l'avvento degli antibiotici altamente attivi negli anni '60, il miele è stato considerato una "sostanza inutile ma innocua" (Soffer, 1976). Tuttavia, la crisi attuale e crescente della resistenza agli antibiotici ha riacceso l'interesse per l'uso del miele, sia come agente efficace di per sé sia come spunto terapeutico per sviluppare nuovi metodi di trattamento. Il miele deriva solitamente dal nettare dei fiori ed è prodotto dalle api, più comunemente dall'ape europea Apis mellifera, ed è un complesso mix di zuccheri, aminoacidi, fenoli e altre sostanze. I tipi di miele derivati da diverse piante da fiore variano sostanzialmente nella loro capacità di uccidere i batteri, e questo ha complicato la letteratura sul miele rendendo talvolta difficile riprodurre i risultati tra studi differenti (Allen et al., 1991; Irish et al., 2011). La maggior parte degli studi recenti che indagano il meccanismo d'azione del miele si sono concentrati sul miele di Manuka attivo, ben caratterizzato e standardizzato, prodotto da alcune specie di Leptospermum native della Nuova Zelanda e dell'Australia, che è stato registrato come prodotto per la cura delle ferite presso gli enti regolatori medici competenti. Pertanto, salvo diversa indicazione, questa recensione si concentrerà sul miele di Manuka.

Analisi chimiche del miele di Manuka attivo

Il professor Peter Molan dell'Università di Waikato, Nuova Zelanda, è stato il primo a segnalare l'attività insolita del miele di Manuka e ha iniziato a testarne l'azione contro un'ampia gamma di specie batteriche a metà degli anni '80. Tuttavia, sebbene fosse chiaro che anche basse concentrazioni di miele di Manuka uccidessero i patogeni batterici, il principio attivo specifico responsabile di ciò è rimasto sfuggente per molti anni. L'elevato contenuto di zucchero e il pH basso rendono il miele inibitorio per la crescita microbica, ma l'attività persiste anche quando questi fattori sono diluiti a livelli trascurabili. Molti diversi tipi di miele producono anche perossido di idrogeno quando la glucosio ossidasi, derivata dall'ape, reagisce con glucosio e acqua. Tuttavia, nel miele di Manuka la produzione di perossido di idrogeno è relativamente bassa e può essere neutralizzata dalla catalasi, eppure l'attività persiste. La causa di questa attività residua, chiamata “attività non perossidica” o NPA, è stata finalmente rivelata nel 2008, quando due laboratori hanno identificato indipendentemente il metilgliossale (MGO) nel miele di Manuka (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008). Il MGO deriva dalla disidratazione spontanea del suo precursore diidrossiacetone (DHA), un fitochimico naturale presente nel nettare dei fiori di Leptospermum scoparium, Leptospermum polygalifolium e di alcune specie correlate di Leptospermum originarie della Nuova Zelanda e dell'Australia (Adams et al., 2009; Williams et al., 2014; Norton et al., 2015). Il MGO può reagire in modo relativamente non specifico con macromolecole come DNA, RNA e proteine (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008; Majtan et al., 2014b) e potrebbe teoricamente essere tossico per le cellule dei mammiferi (Kalapos, 2008). Tuttavia, non ci sono prove di danni alle cellule ospiti quando il miele di Manuka viene consumato per via orale o usato come medicazione per ferite; anzi, il miele sembra stimolare la guarigione e ridurre le cicatrici quando applicato sulle ferite (Biglari et al., 2013; Majtan, 2014; Dart et al., 2015). Come eserciti questa apparente tossicità selettiva verso le cellule batteriche non è noto.

Alti livelli di MGO o perossido di idrogeno solitamente producono il miele più attivo, tuttavia la correlazione non è sempre perfetta, suggerendo che altri componenti del miele possano modulare l'attività (Molan, 2008; Kwakman et al., 2011; Chen et al., 2012; Lu et al., 2013). La defensina-1 delle api, un peptide antimicrobico derivato dalle api, è responsabile dell'attività nel miele Revamil, un miele attivo prodotto da una fonte non divulgata, ma sembra essere strutturalmente modificata e inattiva nel miele Manuka (Kwakman et al., 2011; Majtan et al., 2012). Il livello di leptosina, un glicoside presente esclusivamente nel miele di Leptospermum, è correlato alla potenza e può modulare l'attività antimicrobica del miele Manuka (Kato et al., 2012). Analogamente, vari composti fenolici con potenziale attività antimicrobica possono essere presenti, in particolare nei mieli di colore più scuro, e sebbene si trovino a livelli che da soli difficilmente sono inibitori, possono agire in sinergia tra loro o con altri componenti del miele per produrre o modificare l'attività (Estevinho et al., 2008; Stephens et al., 2010). I fenoli possono anche agire come antiossidanti e potrebbero essere responsabili delle proprietà antinfiammatorie e di guarigione delle ferite del miele (Stephens et al., 2010). Va notato che non tutte le specie di Leptospermum producono miele attivo, e anche all'interno del miele di L. scoparium e L. polygalifolium i livelli di MGO possono variare da ∼100 a >1200 ppm (Windsor et al., 2012). Un'indagine sull'attività del miele australiano ha rilevato che il miele proveniente da piante di Leptospermum che crescono intorno al confine tra New South Wales e Queensland era particolarmente attivo, ma non si sa se ciò sia dovuto a fattori legati alla pianta, al suolo, al clima o ad altri fattori (Irish et al., 2011).

L'inibizione dei patogeni da parte del miele

Il miele è stato testato in vitro su una vasta gamma di patogeni, in particolare quelli che possono colonizzare la pelle, le ferite e le membrane mucose, dove è possibile un trattamento topico con miele. Ad oggi, i test in vitro hanno dimostrato che il miele di Manuka può efficacemente inibire tutti i patogeni batterici problematici testati (riassunti nella Tabella 1). Di particolare interesse è il fatto che gli isolati clinici con fenotipi di resistenza multipla ai farmaci (MDR) non mostrano una riduzione della loro sensibilità al miele, indicando uno spettro d'azione ampio e diverso da qualsiasi antimicrobico conosciuto (Willix et al., 1992; Blair and Carter, 2005; George and Cutting, 2007; Tan et al., 2009). Inoltre, i tentativi di generare ceppi resistenti al miele in laboratorio non hanno avuto successo e non sono stati riportati isolati clinici con resistenza acquisita al miele (Blair et al., 2009; Cooper et al., 2010).

Oltre a inibire le cellule planctoniche, il miele può disperdere e uccidere i batteri che vivono nei biofilm. I biofilm sono comunità di cellule generalmente racchiuse in una matrice extracellulare autoprodotta e si trovano aderenti a superfici, comprese ferite, denti, superfici mucose e dispositivi impiantati. I microbi residenti nei biofilm sono protetti dagli agenti antimicrobici e possono causare infezioni persistenti e non risolutive. Il miele di Manuka interrompe gli aggregati cellulari (Maddocks et al., 2012; Roberts et al., 2012) e previene la formazione di biofilm da parte di un'ampia gamma di patogeni problematici, inclusi i generi Streptococcus e Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumonia (Maddocks et al., 2012, 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a; Halstead et al., 2016). È importante sottolineare che il miele può anche interrompere biofilm già stabiliti e uccidere le cellule residenti, sebbene sia necessaria una concentrazione più elevata rispetto alle cellule planctoniche (Okhiria et al., 2009; Maddocks et al., 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a). Molto recentemente, il miele di Manuka è stato testato su un biofilm multispecie contenente Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis ed è stato riscontrato che riduce la vitalità di tutte le specie tranne E. faecalis, che non è stato possibile eradicare (Sojka et al., 2016). Questo ha chiare implicazioni cliniche per l'uso del miele su ferite contenenti biofilm, e comprendere come il biofilm consenta a E. faecalis di sopravvivere quando normalmente viene ucciso dal miele è un'area importante e interessante per studi futuri. Il MGO sembra essere in gran parte, ma non completamente, responsabile dell'inibizione dei biofilm da parte del miele di Manuka, evidenziando ancora una volta l'importanza di componenti aggiuntivi che modulano l'attività (Kilty et al., 2011; Lu et al., 2014).

Lo spettro di attività del miele verso patogeni non batterici deve ancora essere ben definito. Studi recenti che hanno esaminato l'effetto antivirale del miele Manuka hanno suggerito un potenziale trattamento per il virus varicella-zoster (la causa della varicella e dell'herpes zoster) (Shahzad e Cohrs, 2012) e l'influenza (Watanabe et al., 2014). I patogeni fungini della pelle, inclusi Candida albicans e specie di dermatofiti, sono sostanzialmente meno suscettibili rispetto ai batteri al miele Manuka, ma sono inibiti da miele con alti livelli di produzione di perossido di idrogeno (Brady et al., 1996; Irish et al., 2006). È stato riscontrato che miele Manuka e non Manuka riducono la vitalità delle spore del microsporidio Nosema apis, un importante patogeno delle api, ma il miele non è stato in grado di curare l'infezione delle api una volta che questa era in corso (Malone et al., 2001). Ci sono stati pochissimi studi sull'uso del miele per parassiti protozoi o elminti e questi non hanno utilizzato miele con attività ben caratterizzata, rendendo difficile valutare il significato dei loro risultati (Bassam et al., 1997; Nilforoushzadeh et al., 2007; Sajid e Azim, 2012).

Portare il miele nella medicina tradizionale: studi sperimentali e meccanicistici recenti fanno luce su come funziona il miele

Il miele di Manuka attivo è ampiamente disponibile come agente terapeutico e alimento funzionale, e la maggior parte dei consumatori lo accetta come un prodotto olistico e in qualche modo misterioso. Tuttavia, la mancanza di comprensione su come il miele uccida i batteri e favorisca la guarigione limita la sua accettazione dalla medicina tradizionale, dove è ancora considerato “alternativo” o “complementare”. La stragrande maggioranza degli studi sul miele finora è stata descrittiva, tuttavia studi recenti stanno cercando di svelare come funziona il miele e stanno utilizzando approcci meccanicistici per determinare come agisce a livello cellulare e molecolare.

Studi ultrastrutturali delle cellule e comunità batteriche trattate con miele

Il miele può alterare profondamente la dimensione e la forma delle cellule batteriche, anche se l'entità di questo varia tra le diverse specie batteriche. Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), le colture di S. aureus trattate con miele di Manuka presentavano più cellule con setti completati rispetto a quelle trattate con miele artificiale, suggerendo che le cellule entrassero ma non completassero la fase di divisione del ciclo cellulare, anche se esternamente queste cellule apparivano normali alla microscopia elettronica a scansione (SEM) (Henriques et al., 2010). Più recentemente, l'imaging a contrasto di fase dopo il trattamento con una dose sub-letale di miele di Manuka ha rilevato che le cellule di S. aureus e Bacillus subtilis erano significativamente più piccole e avevano più probabilità di avere DNA condensato rispetto a quelle cresciute senza miele (Lu et al., 2013). È difficile confrontare direttamente questi studi poiché hanno utilizzato quantità diverse di miele e tempi di trattamento differenti, ma nel complesso i risultati suggeriscono un disaccoppiamento tra crescita e divisione cellulare, spesso osservato in risposta a stress nutrizionali e ambientali (Silva-Rocha and de Lorenzo, 2010).

Il trattamento con miele è stato segnalato come causa di cellule anormalmente più corte e più lunghe nelle colture delle specie Gram negative E. coli e P. aeruginosa (Lu et al., 2013). È interessante notare che, mentre P. aeruginosa sembra essere meno suscettibile all’inibizione da miele rispetto ad altre specie, sono stati osservati profondi cambiamenti cellulari tramite TEM e SEM, inclusi solchi e blebs (protuberanze delle membrane plasmatiche cellulari) sulla superficie cellulare e una quantità sostanziale di detriti extracellulari indicativi di lisi cellulare (Henriques et al., 2011). Ciò è stato confermato in uno studio successivo utilizzando la colorazione fluorescente BacLight live-dead e la microscopia confocale, anche se è stato dimostrato che un numero relativamente elevato di cellule vive rimaneva. Questi studi hanno utilizzato il 20% (p/v) di miele, superiore alla MBC per il loro ceppo di P. aeruginosa, e si sarebbe quindi previsto un’inibizione e una morte sostanziali. Tuttavia, la microscopia a forza atomica (AFM) con livelli sub-battericidi ha comunque rilevato una sostanziale distorsione cellulare e blebbing nelle cellule trattate con concentrazioni MIC (12%) e metà MIC (6%), insieme a una lisi cellulare significativa (Roberts et al., 2012). Questa apparente degenerazione della cellula di P. aeruginosa è stata supportata dall’analisi quantitativa PCR che ha mostrato una regolazione negativa di 10 volte in cellule trattate con miele del gene oprF, che codifica per una porina della membrana esterna importante per la stabilità strutturale (Jenkins et al., 2015a).

Analisi ‘Omiche Valutano la Risposta dell’Intera Cellula all’Inibizione da Parte del Miele

La capacità di valutare le risposte dell’intera cellula ha rivoluzionato lo studio delle interazioni tra farmaci e patogeni ed è particolarmente utile per prodotti naturali complessi come il miele, dove sono probabili effetti su molteplici processi. Studi di microarray e proteomica su batteri esposti al miele hanno suggerito un’induzione di processi legati allo stress e una soppressione della sintesi proteica (Blair et al., 2009; Jenkins et al., 2011; Packer et al., 2012). Sebbene nel complesso questa sia una risposta tipica agli agenti inibitori, il miele ha prodotto una “firma” unica di espressione differenziale che includeva molte proteine con funzioni ipotetiche o sconosciute, suggerendo un nuovo meccanismo d’azione. Specifici geni o proteine risultate down-regolate nelle analisi ‘omiche di S. aureus e E. coli O157/H7 hanno funzioni legate alla virulenza, al quorum sensing e alla formazione di biofilm (Lee et al., 2011; Jenkins et al., 2013), e in P. aeruginosa si è osservata una down-regolazione di proteine coinvolte nella flagellazione (Roberts et al., 2015). Questi fenotipi sono critici per i patogeni per stabilirsi e produrre infezioni invasive e indicano che, oltre a inibire la crescita, il miele può ridurre il potenziale patogeno dei batteri infettanti.

Sebbene ancora relativamente limitate per numero e portata, le analisi ‘omiche condotte finora suggeriscono una risposta cellulare complessa al miele con notevole variazione tra le diverse specie batteriche. Sono ora necessari approcci avanzati di biologia dei sistemi che permettano la contestualizzazione dei dati e studi di validazione mediante PCR quantitativa e ceppi con delezione genica per districare questa complessità, che potrebbero rivelare nuovi approcci per terapie farmacologiche mirate a inibire la crescita batterica (Hudson et al., 2012).

Interazioni tra miele e antibiotici convenzionali

Oltre all'uso come agente unico, esiste la possibilità di utilizzare il miele per integrare il trattamento con antibiotici convenzionali. Questo può avere un valore particolare se combinato con agenti sistemici che possono essere trasportati al letto della ferita tramite la circolazione sanguigna mentre il miele viene applicato localmente. I trattamenti combinati possono anche ridurre la dose terapeutica degli agenti antimicrobici e prevenire lo sviluppo di resistenza, e in alcuni casi possono portare a una sinergia farmacologica, in cui l'attività combinata è maggiore della somma delle attività individuali di ciascun farmaco.

Studi in vitro che combinano miele di manuka terapeuticamente approvato con agenti antibiotici hanno riscontrato un effetto sinergico con oxacillina, tetraciclina, imipenem e mupirocina contro la crescita di un ceppo MRSA (Jenkins e Cooper, 2012). Inoltre, la presenza di una concentrazione sub-inibitoria di miele in combinazione con oxacillina ha ripristinato la suscettibilità del ceppo MRSA all'oxacillina. Gli autori hanno riscontrato una down-regolazione di mecR1, che codifica per una proteina legante la penicillina specifica per MRSA (PBP2A), suggerendo questo come meccanismo della sinergia del miele. È stata inoltre riscontrata una forte attività sinergica tra miele di manuka e rifampicina contro molteplici ceppi di S. aureus, inclusi isolati clinici e ceppi MRSA, e la presenza di miele ha impedito l'emergere di resistenza alla rifampicina in vitro (Müller et al., 2013). Ciò ha rilevanza clinica poiché la rifampicina penetra bene nei tessuti e negli ascessi ed è comunemente usata per trattare infezioni stafilococciche superficiali, ma induce rapidamente resistenza e deve quindi essere usata in combinazione con un altro agente. Un ulteriore risultato di questo studio è stato che la sinergia non era dovuta a MGO, poiché un miele sintetico arricchito con MGO non mostrava sinergia con la rifampicina.

Comprendere come il miele influenzi l'azione degli antimicrobici con modalità d'azione ben caratterizzate può anche approfondire la nostra comprensione di come il miele agisca sui patogeni batterici. Liu et al. (2014) hanno esteso l'analisi della sinergia includendo ulteriori antibiotici e diversi ceppi di S. aureus e MRSA. Hanno suggerito che una maggiore suscettibilità a clindamicina e gentamicina potrebbe derivare dall'effetto combinato della sintesi proteica down-regolata dal miele con l'inibizione dei ribosomi da parte degli antibiotici, mentre la sinergia con gli antibiotici β-lattamici potrebbe essere dovuta all'aumento dello stress ossidativo causato da entrambi i partner. Poiché i ceppi di S. aureus e MRSA erano ugualmente suscettibili alla combinazione oxacillina-miele, sembrava improbabile che la sinergia fosse dovuta alla down-regolazione di PBP2A. Tuttavia, in un isolato clinico di MRSA, non si è osservato un aumento della sensibilità a clindamicina o gentamicina in presenza di miele, il che è notevole in quanto è il primo caso riportato di una differenza nella risposta al miele tra MRSA e S. aureus. Indagare questa differenza specifica di ceppo mediante analisi trascrittomiche o proteomiche sarebbe una interessante direzione per future ricerche (Liu et al., 2014).

Prove di efficacia da studi su animali, casi clinici e trial clinici

Le aziende che producono e commercializzano miele di Manuka promuovono elevati standard etici e scoraggiano l’uso di modelli animali per studiare infezioni e guarigione delle ferite. Tuttavia, il miele di Manuka è stato usato per trattare animali con ferite chirurgiche o accidentali, in particolare cavalli, con risultati positivi (Dart et al., 2015; Bischofberger et al., 2016). Rapporti di casi che utilizzano il miele per ferite e ulcere non guaribili hanno osservato un miglioramento significativo con risoluzione dell’infezione dove gli antibiotici convenzionali avevano fallito (Regulski, 2008; Smith et al., 2009). Tuttavia, nonostante ciò e le evidenze da numerosi modelli in vitro e in vivo che il miele uccide patogeni problematici delle ferite, vi è una scarsità di dati clinici solidi per il miele di Manuka. Ci sono varie ragioni per questo, tra cui difficoltà tecniche nel condurre uno studio controllato con placebo in doppio cieco su una sostanza distintiva come il miele, considerazioni etiche, mancanza di interesse da parte dei medici clinici e rapporto costi-benefici per le aziende del miele, il cui focus è sui prodotti naturali e sulle vendite da banco dove il miele di Manuka e le medicazioni associate già hanno un prezzo premium. Questi fattori potrebbero cambiare man mano che la resistenza agli antibiotici erode le opzioni di trattamento attuali e la ricerca continua che evidenzia il potenziale del miele lo porta all’attenzione dei medici.

Lacune e opportunità emergenti nello studio del miele

Sono stati fatti grandi progressi recentemente nella nostra comprensione del miele terapeutico, eppure il suo uso nella medicina clinica rimane limitato, anche quando gli antibiotici convenzionali cominciano a fallire. La complessità del miele, che è probabilmente la sua più grande forza nel uccidere patogeni diversi e prevenire la resistenza, complica il suo studio poiché molti fattori che agiscono insieme probabilmente influenzano l’attività. Sosteniamo ulteriori studi meccanicistici utilizzando miele terapeutico di Manuka opportunamente registrato, in particolare studi che utilizzano approcci di biologia dei sistemi non riduzionisti, insieme ad analisi chimiche e microbiologiche dettagliate per chiarire come il miele agisce a livello molecolare, cellulare e di popolazione, come questo possa differire in diversi ceppi e specie di patogeni microbici, e come risponde la cellula ospite (Tabella 2). Le informazioni ottenute da questi studi possono quindi informare la terapia e produrre i dati clinici necessari per portare il miele nella medicina tradizionale; non più come terapia alternativa usata solo quando tutto il resto ha fallito.

Contributi degli autori

Questa recensione è stata scritta da DC, SB, NNC, DB e PB ed è stata criticamente revisionata da RS ed EH.

Finanziamento

NNC riceve supporto salariale dalla Rural Industries Research and Development Corporation – Honey Bee Program (Grant PRJ-009186).

Dichiarazione di conflitto di interessi

DC, PB e EH riportano supporto finanziario e non finanziario sotto forma di miele di manuka da Comvita NZ Limited e Capilano Honey Limited; RS è impiegato da Comvita NZ Limited, che commercia miele di manuka di grado medico (Medihoney).

Gli altri autori dichiarano che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che possa essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Abbreviazione

ESBL, β-lattamasi a spettro esteso; MBC, concentrazione battericida minima; MGO, metilgliossale; MIC, concentrazione inibitoria minima; MRSA, Staphylococcus aureus resistente alla meticillina; MRSE, Staphylococcus epidermis resistente alla meticillina; NPA, attività non perossidica; VRE, Enterococcus resistente alla vancomicina.

Riferimenti