Miele di Manuka terapeutico: non più così alternativo

Introduzione

Il miele è stato usato come medicina in tutta la storia della razza umana. Uno degli usi terapeutici più comuni e persistenti del miele è stato come medicazione per ferite, quasi certamente a causa delle sue proprietà antimicrobiche. Con l'avvento di antibiotici altamente attivi negli anni '60, il miele fu liquidato come una "sostanza inutile ma innocua" (Soffer, 1976). Tuttavia, l'attuale e crescente crisi della resistenza agli antibiotici ha riacceso l'interesse per l'uso del miele, sia come agente efficace a sé stante sia come punto di partenza terapeutico per sviluppare nuovi metodi di trattamento. Il miele è solitamente derivato dal nettare dei fiori e prodotto dalle api, più comunemente dall'ape europea Apis mellifera, ed è una complessa miscela di zuccheri, aminoacidi, fenoli e altre sostanze. I tipi di miele derivati da diverse piante da fiore variano sostanzialmente nella loro capacità di uccidere i batteri, e questo ha complicato la letteratura sul miele e ha reso talvolta difficile riprodurre i risultati tra diversi studi (Allen et al., 1991; Irish et al., 2011). La maggior parte degli studi recenti che indagano il meccanismo d'azione del miele si sono concentrati sul miele di manuka attivo ben caratterizzato e standardizzato, prodotto da alcune specie di Leptospermum native della Nuova Zelanda e dell'Australia, che è stato registrato come prodotto per la cura delle ferite presso gli organismi di regolamentazione medica competenti. Pertanto, se non specificato diversamente, questa recensione si concentrerà sul miele di manuka.

Analisi Chimiche del Miele di Manuka Attivo

Il Professor Peter Molan dell'Università di Waikato, Nuova Zelanda, è stato il primo a segnalare l'insolita attività del miele di manuka e ha iniziato a testarne l'azione contro una vasta gamma di diverse specie batteriche a metà degli anni '80. Tuttavia, mentre era chiaro che anche basse concentrazioni di miele di manuka uccidevano i patogeni batterici, l'ingrediente attivo specifico responsabile di ciò è rimasto elusivo per molti anni. L'alto contenuto di zucchero e il basso pH rendono il miele inibitorio per la crescita microbica, ma l'attività rimane quando questi vengono diluiti a livelli trascurabili. Molti tipi di miele producono anche perossido di idrogeno quando la glucosio ossidasi, derivata dall'ape, reagisce con il glucosio e l'acqua. Tuttavia, nel miele di manuka la produzione di perossido di idrogeno è relativamente bassa e può essere neutralizzata dalla catalasi, eppure l'attività rimane. La causa di questa attività residua, soprannominata "attività non perossidica" o NPA, è stata finalmente rivelata nel 2008, quando due laboratori hanno identificato indipendentemente il metilgliossale (MGO) nel miele di manuka (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008). L'MGO deriva dalla disidratazione spontanea del suo precursore diidrossiacetone (DHA), un fitochimico naturale presente nel nettare dei fiori di Leptospermum scoparium, Leptospermum polygalifolium, e alcune specie correlate di Leptospermum native della Nuova Zelanda e dell'Australia (Adams et al., 2009; Williams et al., 2014; Norton et al., 2015). L'MGO può reagire in modo relativamente non specifico con macromolecole come DNA, RNA e proteine (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008; Majtan et al., 2014b), e potrebbe teoricamente essere tossico per le cellule dei mammiferi (Kalapos, 2008). Tuttavia, non ci sono prove di danni alle cellule ospiti quando il miele di manuka viene consumato per via orale o usato come medicazione per ferite; anzi il miele sembra stimolare la guarigione e ridurre le cicatrici quando applicato sulle ferite (Biglari et al., 2013; Majtan, 2014; Dart et al., 2015). Non è noto come eserciti questa tossicità apparentemente selettiva sulle cellule batteriche.

Alti livelli di MGO o perossido di idrogeno producono di solito il miele più attivo; tuttavia, la correlazione non è sempre perfetta, suggerendo che altri componenti del miele possano modulare l'attività (Molan, 2008; Kwakman et al., 2011; Chen et al., 2012; Lu et al., 2013). La defensina-1 delle api, un peptide antimicrobico derivato dalle api, è responsabile dell'attività nel miele Revamil, un miele attivo prodotto da una fonte non divulgata, ma questa sembra essere strutturalmente modificata e inattiva nel miele di manuka (Kwakman et al., 2011; Majtan et al., 2012). Il livello di leptosina, un glicoside presente esclusivamente nel miele di Leptospermum, correla con la potenza e può modulare l'attività antimicrobica del miele di manuka (Kato et al., 2012). Allo stesso modo, vari composti fenolici con potenziale attività antimicrobica possono essere presenti, in particolare nei mieli di colore più scuro, e sebbene questi si presentino a livelli che difficilmente sono inibitori da soli, possono sinergizzare tra loro o con altri componenti del miele per produrre o alterare l'attività (Estevinho et al., 2008; Stephens et al., 2010). I fenoli possono anche agire come antiossidanti e possono essere responsabili delle proprietà antinfiammatorie e cicatrizzanti del miele (Stephens et al., 2010). Va notato che non tutte le specie di Leptospermum producono miele attivo, e anche all'interno del miele di L. scoparium e L. polygalifolium i livelli di MGO possono variare da ∼100 a >1200 ppm (Windsor et al., 2012). Un'indagine sull'attività del miele australiano ha rilevato che il miele proveniente da piante di Leptospermum che crescono intorno al confine tra il Nuovo Galles del Sud e il Queensland era particolarmente attivo, ma non è noto se ciò sia dovuto a fattori vegetali, del suolo, climatici o di altro tipo (Irish et al., 2011).

L'Inibizione dei Patogeni da Parte del Miele

Il miele è stato testato in vitro su una vasta gamma di patogeni, in particolare quelli che possono colonizzare la pelle, le ferite e le membrane mucose, dove il trattamento topico con miele è possibile. Ad oggi, i saggi in vitro hanno riscontrato che il miele di manuka può inibire efficacemente tutti i patogeni batterici problematici testati (riassunto nella Tabella 1). Di particolare interesse è che gli isolati clinici con fenotipi di resistenza multipla ai farmaci (MDR) non hanno alcuna riduzione della loro sensibilità al miele, indicando un ampio spettro d'azione che è diverso da qualsiasi antimicrobico conosciuto (Willix et al., 1992; Blair e Carter, 2005; George e Cutting, 2007; Tan et al., 2009). Inoltre, i tentativi di generare ceppi resistenti al miele in laboratorio non hanno avuto successo e non ci sono state segnalazioni di isolati clinici con resistenza acquisita al miele (Blair et al., 2009; Cooper et al., 2010).

Oltre a inibire le cellule planctoniche, il miele può disperdere e uccidere i batteri che vivono in biofilm. I biofilm sono comunità di cellule generalmente racchiuse in una matrice extracellulare auto-prodotta e si trovano aderenti a superfici, incluse ferite, denti, superfici mucose e dispositivi impiantati. I microbi residenti nei biofilm sono protetti dagli agenti antimicrobici e possono causare infezioni persistenti e non risolutive. Il miele di manuka distrugge gli aggregati cellulari (Maddocks et al., 2012; Roberts et al., 2012) e previene la formazione di biofilm da parte di un'ampia gamma di patogeni problematici, tra cui specie di Streptococcus e Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii e Klebsiella pneumonia (Maddocks et al., 2012, 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a; Halstead et al., 2016). È importante sottolineare che il miele può anche distruggere biofilm consolidati e uccidere le cellule residenti, sebbene sia richiesta una concentrazione maggiore rispetto alle cellule planctoniche (Okhiria et al., 2009; Maddocks et al., 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a). Molto recentemente, il miele di manuka è stato testato su un biofilm multispecie contenente Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa e Enterococcus faecalis ed è stato riscontrato che riduce la vitalità di tutte le specie tranne E. faecalis, che non poteva essere eradicato (Sojka et al., 2016). Ciò ha chiare implicazioni cliniche per l'uso del miele sulle ferite contenenti biofilm, e capire come il biofilm consente a E. faecalis di sopravvivere quando normalmente viene ucciso dal miele è un'area di studio futura importante e interessante. L'MGO sembra essere in gran parte, ma non del tutto, responsabile dell'inibizione dei biofilm da parte del miele di manuka, evidenziando ancora una volta l'importanza di componenti aggiuntivi che modulano l'attività (Kilty et al., 2011; Lu et al., 2014).

Lo spettro di attività del miele nei confronti dei patogeni non batterici deve ancora essere ben stabilito. Studi recenti che esaminano l'effetto antivirale del miele di manuka hanno suggerito che ha un potenziale per il trattamento del virus varicella-zoster (la causa della varicella e dell'herpes zoster) (Shahzad e Cohrs, 2012) e dell'influenza (Watanabe et al., 2014). I patogeni fungini della pelle, incluse Candida albicans e le specie di dermatofiti, sono sostanzialmente meno suscettibili ai miele di manuka rispetto ai batteri, ma sono inibiti dal miele con alti livelli di produzione di perossido di idrogeno (Brady et al., 1996; Irish et al., 2006). È stato riscontrato che il miele di manuka e non manuka riducono la vitalità delle spore del microsporidio Nosema apis, un importante patogeno delle api, ma il miele non è stato in grado di curare l'infezione delle api una volta che questa era in corso (Malone et al., 2001). Ci sono stati pochissimi studi sull'uso del miele per parassiti protozoari o elminti e questi non hanno utilizzato miele con attività ben caratterizzata, rendendo difficile valutarne la significatività dei risultati (Bassam et al., 1997; Nilforoushzadeh et al., 2007; Sajid e Azim, 2012).

Portare il Miele nella Medicina Tradizionale: Recenti Studi Sperimentali e Meccanicistici Fanno Luce su Come Funziona il Miele

Il miele attivo di manuka è ampiamente disponibile come agente terapeutico e alimento funzionale, e la maggior parte dei consumatori lo accetta come un prodotto olistico, alquanto misterioso. Tuttavia, la mancanza di comprensione su come il miele uccide i batteri e promuove la guarigione ne limita l'accettazione da parte della medicina tradizionale, dove è ancora considerato "alternativo" o "complementare". La stragrande maggioranza degli studi di ricerca sul miele fino ad oggi sono stati descrittivi, tuttavia, studi recenti stanno cercando di svelare come funziona il miele e stanno utilizzando approcci meccanicistici per determinare come agisce a livello cellulare e molecolare.

Studi Ultrastrutturali di Cellule Batteriche e Comunità Trattate con il Miele

Il miele può alterare profondamente le dimensioni e la forma delle cellule batteriche, sebbene l'entità di ciò vari nelle diverse specie batteriche. Utilizzando la microscopia elettronica a trasmissione (TEM), le colture di S. aureus trattate con miele di manuka avevano più cellule con setti completi rispetto a quelle trattate con miele artificiale, suggerendo che le cellule erano entrate ma non erano riuscite a completare la fase di divisione del ciclo cellulare, sebbene esternamente queste cellule apparissero normali alla microscopia elettronica a scansione (SEM) (Henriques et al., 2010). Più recentemente, l'imaging a contrasto di fase dopo il trattamento con una dose subletale di miele di manuka ha rilevato che le cellule di S. aureus e Bacillus subtilis erano significativamente più piccole e avevano maggiori probabilità di avere DNA condensato rispetto a quelle che crescevano senza miele (Lu et al., 2013). È difficile confrontare direttamente questi studi in quanto hanno utilizzato diverse quantità di miele e tempi di trattamento, ma nel complesso i risultati suggeriscono un disaccoppiamento tra crescita e divisione cellulare, che si osserva spesso in risposta a stress nutrizionali e ambientali (Silva-Rocha e de Lorenzo, 2010).

È stato riportato che il trattamento con miele causa che le colture delle specie Gram negative E. coli e P. aeruginosa abbiano cellule sia anormalmente più corte che più lunghe (Lu et al., 2013). È interessante notare che, sebbene P. aeruginosa sembri essere meno suscettibile all'inibizione da parte del miele rispetto ad altre specie, sono state osservate profonde alterazioni cellulari utilizzando TEM e SEM, inclusi solchi e bolle (protusioni delle membrane plasmatiche cellulari) sulla superficie cellulare e una notevole quantità di detriti extracellulari indicativi di lisi cellulare (Henriques et al., 2011). Questo è stato verificato in uno studio successivo utilizzando la colorazione a fluorescenza BacLight live-dead e la microscopia confocale, sebbene ciò abbia anche dimostrato che rimaneva un numero relativamente elevato di cellule vive. Questi studi hanno utilizzato miele al 20% (p/v), che era superiore alla MBC per il loro ceppo di P. aeruginosa e ci si aspetterebbe un'inibizione e una morte sostanziali. Tuttavia, la microscopia a forza atomica (AFM) utilizzando livelli sub-battericidi ha comunque riscontrato una notevole distorsione cellulare e formazione di bolle nelle cellule trattate con concentrazioni di MIC (12%) e metà MIC (6%), insieme a una notevole lisi cellulare (Roberts et al., 2012). Questa apparente degenerazione della cellula di P. aeruginosa è stata supportata dall'analisi quantitativa della PCR che ha mostrato una sottoregolazione di 10 volte nelle cellule trattate con miele di oprF, che codifica una porina della membrana esterna importante per la stabilità strutturale (Jenkins et al., 2015a).

Analisi omiche Valutano la Risposta a Livello di Cellula Intera all'Inibizione da Parte del Miele

La capacità di valutare i risultati a livello di cellula intera ha rivoluzionato lo studio delle interazioni farmaco-patogeno e ha un valore particolare per prodotti naturali complessi come il miele, dove è probabile che si verifichino effetti su molteplici processi. Studi di microarray e proteomici di batteri esposti al miele hanno suggerito un'induzione di processi correlati allo stress e la soppressione della sintesi proteica (Blair et al., 2009; Jenkins et al., 2011; Packer et al., 2012). Sebbene nel complesso ciò sia abbastanza tipico di una risposta agli agenti inibitori, il miele ha prodotto una "firma" unica di espressione differenziale che includeva molte proteine con funzioni ipotetiche o sconosciute, suggerendo una modalità d'azione nuova. Geni o proteine specifici trovati sottoregolati nelle analisi omiche di S. aureus ed E. coli O157/H7 hanno funzioni relative a virulenza, quorum sensing e formazione di biofilm (Lee et al., 2011; Jenkins et al., 2013), e in P. aeruginosa c'è stata una sottoregolazione delle proteine coinvolte nella flagellazione (Roberts et al., 2015). Questi fenotipi sono critici per i patogeni per stabilire e produrre infezioni invasive e indicano che, oltre a inibire la crescita, il miele può ridurre il potenziale patogeno dei batteri infettanti.

Sebbene ancora relativamente limitate in numero e portata, le analisi omiche condotte finora suggeriscono una complessa risposta cellulare al miele con una considerevole variazione nelle diverse specie batteriche. Sono ora necessari approcci avanzati di biologia dei sistemi che consentano la contestualizzazione dei dati e studi di validazione che utilizzino PCR quantitativa e ceppi con delezione genica, per svelare questa complessità, e questi potrebbero rivelare nuovi approcci per terapie farmacologiche volte a inibire la crescita batterica (Hudson et al., 2012).

Interazioni tra miele e antibiotici convenzionali

Oltre all'uso come unico agente, c'è la possibilità di utilizzare il miele per aumentare il trattamento con antibiotici convenzionali. Questo può avere un valore particolare se combinato con agenti sistemici che possono essere consegnati a un letto della ferita tramite la circolazione sanguigna mentre il miele viene applicato localmente. I trattamenti combinati possono anche abbassare la dose terapeutica di agenti antimicrobici e prevenire lo sviluppo di resistenza, e in alcuni casi possono portare a sinergia farmacologica, dove l'attività combinata è maggiore della somma delle attività individuali di ciascun partner farmacologico.

Studi in vitro che combinano miele di manuka terapeuticamente approvato con agenti antibiotici hanno riscontrato un effetto sinergico con oxacillina, tetraciclina, imipenem e mupirocina contro la crescita di un ceppo di MRSA (Jenkins e Cooper, 2012). Inoltre, la presenza di una concentrazione sub-inibitoria di miele in combinazione con oxacillina ha ripristinato la suscettibilità all'oxacillina del ceppo MRSA. Gli autori hanno riscontrato una sottoregolazione di mecR1, che codifica una proteina legante la penicillina (PBP2A) specifica per MRSA e hanno suggerito questo come meccanismo di sinergia del miele. È stata inoltre riscontrata una forte attività sinergica tra miele di manuka e rifampicina contro ceppi multipli di S. aureus, inclusi isolati clinici e ceppi MRSA, e la presenza di miele ha impedito l'insorgenza di resistenza alla rifampicina in vitro (Müller et al., 2013). Questo ha rilevanza clinica poiché la rifampicina penetra bene nei tessuti e negli ascessi ed è comunemente usata per trattare le infezioni stafilococciche superficiali, ma induce rapidamente resistenza e deve quindi essere usata in combinazione con un altro agente. Un ulteriore risultato di questo studio è stato che la sinergia non era dovuta a MGO, poiché un miele sintetico arricchito con MGO non era sinergico con la rifampicina.

Capire come il miele influenzi l'azione degli antimicrobici con meccanismi d'azione ben caratterizzati può anche approfondire la nostra comprensione di come il miele influenzi i patogeni batterici. Liu et al. (2014) hanno esteso l'analisi della sinergia per includere antibiotici aggiuntivi e diversi ceppi di S. aureus e MRSA. Hanno suggerito che una maggiore suscettibilità a clindamicina e gentamicina potrebbe derivare dall'effetto combinato della sintesi proteica sottoregolata dal miele con l'inibizione dei ribosomi da parte degli antibiotici, mentre la sinergia con gli antibiotici β-lattamici potrebbe essere dovuta all'aumento dello stress ossidativo causato da entrambi i partner. Poiché i ceppi di S. aureus e MRSA erano ugualmente suscettibili alla combinazione oxacillina-miele, sembrava improbabile che la sinergia fosse dovuta alla sottoregolazione della PBP2A. In un isolato clinico di MRSA, tuttavia, non vi è stato alcun aumento della sensibilità a clindamicina o gentamicina quando il miele era presente, il che è notevole in quanto è il primo caso segnalato di una differenza nella risposta al miele da parte di MRSA rispetto a S. aureus. Indagare questa differenza ceppo-specifica utilizzando analisi trascrittomiche o proteomiche sarebbe un interessante percorso per la ricerca futura (Liu et al., 2014).

Prove di Efficacia da Studi su Animali, Rapporti di Casi e Studi Clinici

Le aziende che producono e commercializzano il miele di manuka promuovono elevati standard etici e scoraggiano l'uso di modelli animali per studiare infezioni e guarigione delle ferite. Il miele di manuka è stato, tuttavia, utilizzato per trattare animali con ferite chirurgiche o accidentali, in particolare i cavalli, con esiti positivi (Dart et al., 2015; Bischofberger et al., 2016). Rapporti di casi che utilizzano il miele per ferite e ulcere non cicatrizzanti hanno rilevato un miglioramento significativo con la risoluzione dell'infezione laddove gli antibiotici convenzionali avevano fallito (Regulski, 2008; Smith et al., 2009). Tuttavia, nonostante ciò e le prove da numerosi modelli in vitro e in vivo che il miele uccide i patogeni problematici delle ferite, c'è una scarsità di dati clinici robusti per il miele di manuka. Ci sono varie ragioni per questo, comprese le difficoltà tecniche nell'eseguire uno studio randomizzato, in doppio cieco, controllato con placebo su una sostanza distintiva come il miele, considerazioni etiche, mancanza di interesse da parte dei medici e il rapporto costi-benefici per le aziende di miele, il cui obiettivo è sui prodotti naturali e sulle vendite da banco dove il miele di manuka e le medicazioni associate già comandano un prezzo premium. Questi potrebbero cambiare man mano che la resistenza agli antibiotici erode le attuali opzioni terapeutiche e la ricerca in corso che evidenzia il potenziale del miele lo porta all'attenzione dei medici.

Lacune e nuove opportunità nello studio del miele

Grandi progressi sono stati fatti di recente nella nostra comprensione del miele terapeutico, eppure il suo impiego in medicina clinica rimane limitato, anche quando gli antibiotici convenzionali stanno cominciando a fallire. La complessità del miele, che è probabilmente il suo maggiore punto di forza nell'uccidere diversi patogeni e prevenire la resistenza, ne complica lo studio poiché molti fattori che agiscono insieme probabilmente influenzano l'attività. Sosteniamo ulteriori studi meccanicistici che utilizzino miele di manuka terapeutico appropriatamente registrato, in particolare studi che utilizzino approcci di biologia dei sistemi non riduzionisti, insieme ad analisi chimiche e microbiologiche dettagliate per chiarire come il miele agisce a livello molecolare, cellulare e di popolazione, come ciò possa differire in diversi ceppi e specie di patogeni microbici e come risponde la cellula ospite (Tabella 2). Le informazioni ottenute da questi studi possono quindi informare la terapia e produrre i dati clinici necessari per portare il miele nella medicina tradizionale; non più la terapia alternativa usata solo quando tutto il resto ha fallito.

Contributi degli Autori

Questa recensione è stata scritta da DC, SB, NNC, DB e PB ed è stata criticamente revisionata da RS ed EH.

Finanziamenti

NNC riceve supporto salariale dal Programma Miele dell'Rural Industries Research and Development Corporation (Grant PRJ-009186).

Dichiarazione di Conflitto di Interessi

DC, PB ed EH dichiarano finanziamenti e supporto non finanziario sotto forma di miele di manuka da Comvita NZ Limited e Capilano Honey Limited; RS è impiegato da Comvita NZ Limited, che commercializza miele di manuka di grado medicale (Medihoney).

Il resto degli autori dichiara che la ricerca è stata condotta in assenza di qualsiasi relazione commerciale o finanziaria che potesse essere interpretata come un potenziale conflitto di interessi.

Abbreviazioni

ESBL, beta-lattamasi a spettro esteso; MBC, concentrazione battericida minima; MGO, metilgliossale; MIC, concentrazione minima inibitoria; MRSA, Staphylococcus aureus resistente alla meticillina; MRSE, Staphylococcus epidermis resistente alla meticillina; NPA, attività non perossidica; VRE, Enterococcus resistente alla vancomicina.

Riferimenti