Terapeutisk Manuka-honung: Inte längre så alternativ

Inledning

Honung har använts som läkemedel genom hela människans historia. En av de vanligaste och mest bestående terapeutiska användningarna av honung har varit som sårförband, nästan säkert på grund av dess antimikrobiella egenskaper. När mycket effektiva antibiotika introducerades på 1960-talet avfärdades honung som ett ”värdelöst men ofarligt ämne” (Soffer, 1976). Den nuvarande och växande krisen med antibiotikaresistens har emellertid väckt nytt intresse för användningen av honung, både som ett effektivt medel i sig och som en terapeutisk utgångspunkt för att utveckla nya behandlingsmetoder. Honung kommer vanligtvis från blommors nektar och produceras av bin, oftast det europeiska honungsbiet Apis mellifera, och är en komplex blandning av sockerarter, aminosyror, fenoliska ämnen och andra substanser. Honungstyper från olika blommande växter varierar avsevärt i sin förmåga att döda bakterier, vilket har komplicerat litteraturen om honung och ibland gjort det svårt att reproducera resultat från olika studier (Allen et al., 1991; Irish et al., 2011). De flesta nyare studier som undersöker honungens verkningsmekanism har fokuserat på välkarakteriserad, standardiserad aktiv Manuka-honung som produceras av vissa Leptospermum-arter som är inhemska i Nya Zeeland och Australien och som har registrerats som en sårvårdsprodukt hos relevanta medicinska tillsynsmyndigheter. Om inget annat anges kommer denna översikt därför att fokusera på Manuka-honung.

Kemiska analyser av aktiv Manuka-honung

Professor Peter Molan vid Waikato University i Nya Zeeland var den första att rapportera manukahonungens ovanliga aktivitet och började i mitten av 1980-talet testa dess verkan mot ett stort antal olika bakteriearter. Även om det stod klart att även låga koncentrationer av manukahonung dödade bakteriella patogener förblev den specifika aktiva ingrediens som låg bakom detta okänd i många år. Hög sockerhalt och lågt pH gör honung hämmande för mikrobiell tillväxt, men aktiviteten kvarstår när dessa späds ut till försumbara nivåer. Många olika typer av honung producerar också väteperoxid när glukosoxidas, som kommer från honungsbiet, reagerar med glukos och vatten. I manukahonung är dock produktionen av väteperoxid relativt låg och kan neutraliseras av katalas, men aktiviteten kvarstår ändå. Orsaken till denna kvarvarande aktivitet, som kallades ”icke-peroxidaktivitet” eller NPA, avslöjades slutligen 2008, när två laboratorier oberoende av varandra identifierade metylglyoxal (MGO) i manukahonung (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008). MGO bildas genom spontan dehydrering av dess prekursor dihydroxiaceton (DHA), ett naturligt förekommande fytokemiskt ämne som finns i nektarn från blommor av Leptospermum scoparium, Leptospermum polygalifolium och vissa närbesläktade Leptospermum-arter som hör hemma i Nya Zeeland och Australien (Adams et al., 2009; Williams et al., 2014; Norton et al., 2015). MGO kan reagera relativt ospecifikt med makromolekyler som DNA, RNA och proteiner (Adams et al., 2008; Mavric et al., 2008; Majtan et al., 2014b) och skulle i teorin kunna vara giftigt för däggdjursceller (Kalapos, 2008). Det finns dock inga belägg för skador på värdceller när manukahonung antingen intas oralt eller används som sårförband; honung verkar faktiskt stimulera läkningen och minska ärrbildningen när den appliceras på sår (Biglari et al., 2013; Majtan, 2014; Dart et al., 2015). Hur honung utövar denna till synes selektiva toxicitet mot bakterieceller är inte känt.

Höga halter av MGO eller väteperoxid ger vanligtvis den mest aktiva honungen, men sambandet är inte alltid perfekt, vilket tyder på att andra komponenter i honungen kan modulera aktiviteten (Molan, 2008; Kwakman et al., 2011; Chen et al., 2012; Lu et al., 2013). Bee defensin-1, en antimikrobiell peptid från bin, står för aktiviteten i Revamil-honung, en aktiv honung som produceras från en icke offentliggjord källa, men detta verkar vara strukturellt modifierat och inaktivt i manukahonung (Kwakman et al., 2011; Majtan et al., 2012). Halten av leptosin, en glykosid som uteslutande finns i honung från Leptospermum, korrelerar med styrkan och kan modulera manukahonungens antimikrobiella aktivitet (Kato et al., 2012). På liknande sätt kan olika fenoliska föreningar med potentiell antimikrobiell aktivitet förekomma, särskilt i mörkare honungssorter, och även om de förekommer i halter som sannolikt inte är hämmande på egen hand kan de samverka med varandra eller andra komponenter i honungen för att framkalla eller förändra aktiviteten (Estevinho et al., 2008; Stephens et al., 2010). Fenoliska föreningar kan också fungera som antioxidanter och kan ligga bakom honungens antiinflammatoriska och sårläkande egenskaper (Stephens et al., 2010). Det bör noteras att inte alla Leptospermum-arter producerar aktiv honung, och även inom L. scoparium och L. polygalifolium kan MGO-halterna variera från ∼100 till >1200 ppm (Windsor et al., 2012). En undersökning av aktiviteten hos australisk honung visade att honung från Leptospermum-växter som växer kring gränsen mellan New South Wales och Queensland var särskilt aktiv, men det är inte känt om detta beror på växt-, jord-, klimat- eller andra faktorer (Irish et al., 2011).

Hämning av patogener genom honung

Honung har testats in vitro på ett brett spektrum av patogener, särskilt sådana som kan kolonisera huden, sår och slemhinnor, där lokal behandling med honung är möjlig. Hittills har in vitro-analyser visat att Manuka-honung effektivt kan hämma alla testade problematiska bakteriella patogener (sammanfattas i tabell 1). Av särskilt intresse är att kliniska isolat med multiresistenta (MDR) fenotyper inte har någon minskad känslighet för honung, vilket visar på ett brett verkningsspektrum som skiljer sig från alla kända antimikrobiella medel (Willix et al., 1992; Blair and Carter, 2005; George and Cutting, 2007; Tan et al., 2009). Dessutom har försök att framkalla honungsresistenta stammar i laboratoriet inte varit framgångsrika, och det har inte rapporterats om kliniska isolat med förvärvad resistens mot honung (Blair et al., 2009; Cooper et al., 2010).

Förutom att hämma planktoniska celler kan honung skingra och döda bakterier som lever i biofilmer. Biofilmer är cellgemenskaper som vanligtvis är inneslutna i en extracellulär matrix som de själva har producerat och som finns fästa på ytor, inklusive sår, tänder, slemhinnor och implanterade medicintekniska produkter. Mikroorganismer i biofilmer skyddas från antimikrobiella ämnen och kan orsaka ihållande infektioner som inte läker ut. Manuka-honung stör cellulära aggregat (Maddocks et al., 2012; Roberts et al., 2012) och förhindrar bildandet av biofilmer hos ett brett spektrum av problematiska patogener, inklusive arter av Streptococcus och Staphylococcus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, Proteus mirabilis, Enterobacter cloacae, Acinetobacter baumannii och Klebsiella pneumonia(Maddocks et al., 2012, 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a; Halstead et al., 2016) Det är viktigt att honung även kan störa etablerade biofilmer och döda kvarvarande celler, även om en högre koncentration krävs än för planktoniska celler (Okhiria et al., 2009; Maddocks et al., 2013; Lu et al., 2014; Majtan et al., 2014a). Mycket nyligen testades Manuka-honung på en biofilm med flera arter som innehöll Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Pseudomonas aeruginosa och Enterococcus faecalis, och det visade sig att honungen minskade livsdugligheten hos alla arter utom E. faecalis, som inte kunde utrotas (Sojka et al., 2016). Detta har tydliga kliniska konsekvenser för användning av honung på sår som innehåller biofilmer, och att förstå hur biofilmen gör det möjligt för E. faecalis att överleva när bakterien normalt dödas av honung är ett viktigt och intressant område för framtida forskning. MGO verkar vara huvudsakligen, men inte helt, ansvarigt för Manuka-honungens hämning av biofilmer, vilket återigen belyser betydelsen av ytterligare komponenter som modulerar aktiviteten (Kilty et al., 2011; Lu et al., 2014).

Spektrumet av honungens aktivitet mot icke-bakteriella patogener är ännu inte väl fastställt. Nya studier som undersökt den antivirala effekten hos Manuka-honung tyder på att den kan ha potential vid behandling av varicella-zoster-virus (orsaken till vattkoppor och bältros) (Shahzad and Cohrs, 2012) och influensa (Watanabe et al., 2014). Svamppatogener på huden, inklusive Candida albicans och dermatofytarter, är betydligt mindre känsliga för Manuka-honung än bakterier, men hämmas av honung med hög produktion av väteperoxid (Brady et al., 1996); Irish et al., 2006). Manuka-honung och honung från andra blommor än Manuka har visat sig minska överlevnaden hos sporer av mikrosporidien Nosema apis, en viktig patogen hos bin, men honung kunde inte bota infektion hos bin när den väl hade brutit ut (Malone et al., 2001). Det har gjorts mycket få studier av honungens användning mot protozoiska eller helmintiska parasiter, och i dessa har honung med välkarakteriserad aktivitet inte använts, vilket gör det svårt att bedöma betydelsen av deras resultat (Bassam et al., 1997); Nilforoushzadeh et al., 2007); Sajid and Azim, 2012).

Att föra in honung i den etablerade medicinen: Nya experimentella och mekanistiska studier kastar ljus över hur honung fungerar

Aktiv Manuka-honung är allmänt tillgänglig som terapeutiskt medel och funktionellt livsmedel, och de flesta konsumenter ser den som en holistisk, något mystisk produkt. Bristande förståelse för hur honung dödar bakterier och främjar läkning begränsar dock dess acceptans inom den etablerade medicinen, där den fortfarande betraktas som ”alternativ” eller ”komplementär”. Den överväldigande majoriteten av forskningen om honung hittills har varit beskrivande, men nyare studier försöker klarlägga hur honung verkar och använder mekanistiska metoder för att fastställa hur den verkar på cellulär och molekylär nivå.

Ultrastrukturella studier av bakterieceller och bakteriesamhällen behandlade med honung

Honung kan påtagligt förändra bakteriecellernas storlek och form, även om omfattningen varierar mellan olika bakteriearter. Med hjälp av transmissionselektronmikroskopi (TEM) hade odlingar av S. aureus som behandlats med Manuka-honung fler celler med färdigbildade septa jämfört med celler som behandlats med konstgjord honung. Detta tyder på att cellerna gick in i, men inte lyckades slutföra, celldelningsstadiet i cellcykeln, även om dessa celler utvändigt såg normala ut vid svepelektronmikroskopi (SEM) (Henriques et al., 2010). I en senare studie visade faskontrastavbildning efter behandling med en subletal dos Manuka-honung att celler av S. aureus och Bacillus subtilis var betydligt mindre och oftare hade kondenserat DNA än celler som växte utan honung (Lu et al., 2013). Det är svårt att jämföra dessa studier direkt eftersom de använde olika mängder honung och olika behandlingstider, men resultaten tyder överlag på en frikoppling mellan tillväxt och celldelning, vilket ofta ses som svar på näringsmässig och miljörelaterad stress (Silva-Rocha and de Lorenzo, 2010).

Honungsbehandling har rapporterats leda till att kulturer av de gramnegativa arterna E. coli och P. aeruginosa innehåller både onormalt korta och långa celler (Lu et al., 2013). Intressant nog sågs omfattande cellförändringar med TEM och SEM hos P. aeruginosa, som verkar vara mindre känslig för hämning av honung än andra arter. Förändringarna omfattade fåror och blåsbildningar (utbuktningar av cellens plasmamembran) på cellytan samt en betydande mängd extracellulärt skräp som tydde på celllys (Henriques et al., 2011). Detta verifierades i en senare studie med BacLight-fluorescensfärgning för levande och döda celler samt konfokalmikroskopi, även om studien också visade att ett relativt stort antal levande celler fanns kvar. Dessa studier använde 20 % (v/v) honung, vilket var högre än MBC-värdet för deras stam av P. aeruginosa, och betydande hämning och celldöd kunde förväntas. Atomkraftsmikroskopi (AFM) med subbaktericida nivåer visade dock fortfarande betydande celldeformation och blåsbildning i celler som behandlats med MIC- (12 %) och halva MIC-koncentrationen (6 %), tillsammans med omfattande celllys (Roberts et al., 2012). Denna uppenbara degenerering av P. aeruginosa-cellen stöddes av en kvantitativ PCR-analys som visade en tiofaldig nedreglering av oprF i honungsbehandlade celler. oprF kodar för ett porin i det yttre membranet som är viktigt för strukturell stabilitet (Jenkins et al., 2015a).

”Omicsanalyser bedömer hela cellens respons på hämning av honung

Möjligheten att bedöma hela cellers resultat har revolutionerat studiet av interaktioner mellan läkemedel och patogener och är särskilt värdefull för komplexa naturprodukter som honung, där effekter på flera processer är sannolika. Mikroarray- och proteomikstudier av bakterier som exponerats för honung tydde på en induktion av stressrelaterade processer och hämning av proteinsyntesen (Blair et al., 2009); Jenkins et al., 2011; Packer et al., 2012). Även om detta överlag är ganska typiskt för ett svar på hämmande medel gav honung en unik ”signatur” av differentiellt uttryck som omfattade många proteiner med hypotetiska eller okända funktioner, vilket tyder på en ny verkningsmekanism. Specifika gener eller proteiner som visade sig vara nedreglerade i ’omics-analyser av S. aureus och E. coli O157/H7 har funktioner kopplade till virulens, kvorum sensing och biofilmsbildning (Lee et al., 2011; Jenkins et al., 2013), och hos P. aeruginosa sågs en nedreglering av proteiner som medverkar i bildandet av flageller (Roberts et al., 2015). Dessa fenotyper är avgörande för att patogener ska kunna etablera sig och orsaka invasiva infektioner och visar att honung, utöver att hämma tillväxten, kan minska den patogena potentialen hos infekterande bakterier.

Även om de fortfarande är relativt begränsade till antal och omfattning tyder de ’omics-analyser som hittills har genomförts på ett komplext cellulärt svar på honung, med betydande variation mellan olika bakteriearter. Avancerade systembiologiska metoder som möjliggör kontextualisering av data, samt valideringsstudier med kvantitativ PCR och stammar med gendeletioner, krävs nu för att reda ut denna komplexitet. Dessa kan avslöja nya angreppssätt för läkemedelsbehandlingar som syftar till att hämma bakterietillväxt (Hudson et al., 2012).

Interaktioner mellan honung och konventionella antibiotika

Förutom användning som enda behandlingsmedel finns det möjlighet att använda honung för att komplettera behandling med konventionella antibiotika. Detta kan vara särskilt värdefullt i kombination med systemiska medel som kan transporteras till ett sår via blodcirkulationen medan honung appliceras lokalt. Kombinationsbehandlingar kan också minska den terapeutiska dosen av antimikrobiella medel och förhindra utveckling av resistens, och kan i vissa fall leda till läkemedelssynergi, där den kombinerade aktiviteten är större än summan av den individuella aktiviteten hos de båda läkemedlen.

In vitro-studier där terapeutiskt godkänd Manuka-honung kombinerats med antibiotika har visat en synergistisk effekt av oxacillin, tetracyklin, imipenem och mupirocin mot tillväxten av en MRSA-stam (Jenkins and Cooper, 2012). Dessutom återställde en subinhibitorisk koncentration av honung i kombination med oxacillin MRSA-stammens känslighet för oxacillin. Författarna fann nedreglering av mecR1, som kodar för ett MRSA-specifikt penicillinbindande protein (PBP2A), och föreslog detta som en mekanism bakom honungens synergi. Stark synergistisk aktivitet mellan Manuka-honung och rifampicin mot flera stammar av S. aureus, inklusive kliniska isolat och MRSA-stammar, har också konstaterats, och honungens närvaro förhindrade uppkomsten av rifampicinresistens in vitro (Müller et al., 2013). Detta har klinisk betydelse eftersom rifampicin tränger väl in i vävnader och abscesser och ofta används för att behandla ytliga stafylokockinfektioner, men snabbt framkallar resistens och därför måste användas i kombination med ett annat medel. Ett ytterligare resultat från denna studie var att synerg​​in inte berodde på MGO, eftersom syntetisk honung med tillsatt MGO inte var synergistisk med rifampicin.

Att förstå hur honung påverkar effekten av antimikrobiella medel med välkarakteriserade verkningsmekanismer kan också öka vår förståelse av hur honung påverkar bakteriella patogener. Liu et al. (2014) utvidgade analysen av synergi till att omfatta ytterligare antibiotika samt olika stammar av S. aureus och MRSA. De föreslog att en ökad känslighet för klindamycin och gentamicin kan bero på den kombinerade effekten av nedreglerad proteinsyntes orsakad av honung och hämning av ribosomer genom antibiotikan, medan synergi med β-laktamantibiotika kan bero på ökad oxidativ stress orsakad av båda parterna. Eftersom stammar av S. aureus och MRSA var lika känsliga för kombinationen av oxacillin och honung verkade det osannolikt att synerg​​in berodde på nedreglering av PBP2A. I ett kliniskt MRSA-isolat sågs dock ingen ökad känslighet för klindamycin eller gentamicin när honung fanns närvarande, vilket är anmärkningsvärt eftersom det är det första rapporterade fallet av en skillnad i MRSA:s och S. aureus- känslighet för honung. Att undersöka denna stamspecifika skillnad med transkriptomiska eller proteomiska analyser skulle vara en intressant väg för framtida forskning (Liu et al., 2014).

Evidens för effekt från djurstudier, fallrapporter och kliniska prövningar

Företag som producerar och marknadsför Manuka-honung främjar höga etiska standarder och avråder från användning av djurmodeller för att studera infektioner och sårläkning. Manuka-honung har dock använts för att behandla djur med kirurgiska eller oavsiktliga sår, särskilt hästar, med positiva resultat (Dart et al., 2015; Bischofberger et al., 2016). Fallrapporter där honung använts för svårläkta sår och sårbildningar har visat betydande förbättringar och att infektioner gått tillbaka när konventionella antibiotika hade misslyckats (Regulski, 2008; Smith et al., 2009). Trots detta och evidensen från många in vitro- och in vivo-modeller som visar att honung avdödar problematiska sårpatogener finns det få robusta kliniska data om Manuka-honung. Det finns flera orsaker till detta, bland annat tekniska svårigheter med att genomföra en dubbelblind, placebokontrollerad studie av ett så särpräglat ämne som honung, etiska överväganden, bristande intresse bland kliniskt verksamma samt kostnad kontra nytta för honungsföretag, vars fokus ligger på naturprodukter och receptfri försäljning där Manuka-honung och tillhörande förband redan betingar ett högt pris. Detta kan förändras när antibiotikaresistens urholkar dagens behandlingsalternativ och pågående forskning som belyser honungens potential gör den uppmärksammad bland läkare.

Kunskapsluckor och nya möjligheter inom honungsforskningen

Stora framsteg har nyligen gjorts i vår förståelse av honung för terapeutiskt bruk, men dess användning inom klinisk medicin är fortfarande begränsad, även när konventionella antibiotika börjar svikta. Honungens komplexitet, som sannolikt är dess största styrka när det gäller att avdöda olika patogener och förhindra resistens, försvårar studier av den eftersom många samverkande faktorer sannolikt påverkar aktiviteten. Vi förespråkar ytterligare mekanistiska studier med lämpligt registrerad terapeutisk Manuka-honung, i synnerhet studier som använder icke-reduktionistiska systembiologiska angreppssätt, tillsammans med detaljerade kemiska och mikrobiologiska analyser för att klarlägga hur honung verkar på molekylär, cellulär och populationsnivå, hur detta kan skilja sig mellan olika stammar och arter av mikrobiella patogener, samt hur värdcellen reagerar (Tabell 2). Informationen från dessa studier kan sedan vägleda behandlingen och ge de kliniska data som krävs för att föra in honung i den etablerade sjukvården; så att den inte längre är en alternativ behandling som endast används när allt annat har misslyckats.

Författarnas bidrag

Denna översikt skrevs av DC, SB, NNC, DB och PB och granskades kritiskt av RS och EH.

Finansiering

NNC får lönestöd från Rural Industries Research and Development Corporation – Honey Bee Program (anslag PRJ-009186).

Intressekonflikt

DC, PB och EH uppger att de får bidrag och icke-ekonomiskt stöd i form av Manuka-honung från Comvita NZ Limited och Capilano Honey Limited; RS är anställd av Comvita NZ Limited, som handlar med medicinsk Manuka-honung (Medihoney).

De övriga författarna uppger att forskningen genomfördes utan kommersiella eller ekonomiska relationer som skulle kunna betraktas som en potentiell intressekonflikt.

Förkortning

ESBL, betalaktamas med utvidgat spektrum; MBC, minsta bakteriedödande koncentration; MGO, metylglyoxal; MIC, minsta hämmande koncentration; MRSA, meticillinresistent Staphylococcus aureus; MRSE, meticillinresistent Staphylococcus epidermis; NPA, peroxidoberoende aktivitet; VRE, vankomycinresistent Enterococcus.

Referenser